【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型核苷酸类似物和使用方法
[0001]本申请要求于2019年7月9日提交的美国临时申请第62/872,164号的优先权，所述美国临时申请的内容特此通过引用并入。
[0002]贯穿本申请，引用了各种出版物和专利。这些参考文献的完整引用在紧接在权利要求书前的说明书的结尾处可见。这些出版物和专利的公开内容以其全文通过引用特此并入本申请中，以更全面地描述本专利技术所属领域的现状。
[0003]本申请通过引用并入了核苷酸和/或氨基酸序列，所述核苷酸和/或氨基酸序列存在于名为“200824_90884
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A
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PCT_Sequence_Listing_BI.txt”的文件中，所述文件大小为2.81千字节，并且所述文件于2020年8月19日以与MS
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Windows具有操作系统兼容性的的IBM
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PC机器格式创建，所述文件包含在于2020年8月24日提交的文本文件中作为本申请的一部分。
技术介绍
[0004]DNA测序是生物和医学研究中的基本工具，并且对于个性化医疗范式而言尤其重要。为了最终实现1,000美元基因组的目标，已经研究了各种新的DNA测序方法；主要的方法是边合成边测序(SBS)，这是一种在聚合酶反应期间确定DNA序列的方法(Hyman 1988；Ronaghi等人1998；Ju等人2003；Li 2003；Braslavsky等人2003；Ruparel等人2005；Margulies等人2005；Ju等人2006；Wu等人2007；Guo等人20...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核苷酸类似物，其具有以下结构：其中：碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；可切割接头包括DTM、偶氮基、2
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硝基苄基、烯丙基、叠氮基甲基或TCO衍生物并通过嘧啶(C、U)的5位置或去氮嘌呤(A、G、I)的7位置连接到所述碱基；并且标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于染料连接的锚定物、用于染料连接的锚定物簇、或锚定物和染料。2.根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中标记选自荧光素、罗丹明、花青、ATTO和Dyomics染料。3.根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中标记包括Cy3、Cy5或HCyC
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646。4.根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中标记是具有供体染料和受体染料的能量转移染料或能量转移染料簇，其中所述供体染料可以是量子点。5.根据权利要求4所述的核苷酸类似物，其中标记是能量转移染料，并且所述供体染料是荧光素、CyA、Cy3，并且所述受体染料是罗丹明110、R6G、TAMRA、ROX、Cy5、HCyC
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646、Alexa 647。6.根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中标记是锚定物，并且所述锚定物包括生物素、DBCO、TCO或四嗪，并且其中锚定物结合分子包括链霉亲和素、叠氮化物、四嗪或TCO并且进一步包括单一染料、单一染料簇或能量转移染料。7.根据权利要求6所述的核苷酸类似物，其中所述锚定物结合分子用有机染料或量子点标记。8.根据权利要求1到6中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于DTM的。9.根据权利要求1到6中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于偶氮基的。10.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中所述四种不同的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物连接有不同的染料。11.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物中的两种核苷酸类似物包括第一染料，并且其余两种核苷酸类似物包括第二染料。12.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过相同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。13.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过不同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。14.一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；R包括甲基、乙基、丙基、叔丁基、芳基、烷基芳基；可切割接头包括DTM、偶氮基、2
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硝基苄基、烯丙基、叠氮基甲基或TCO衍生物；并且标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于连接荧光染料的锚定物、用于连接荧光染料的锚定物簇、或锚定物和染料。15.根据权利要求14所述的核苷酸类似物，其中标记选自荧光素、罗丹明、花青、ATTO和Dyomics染料。16.根据权利要求14所述的核苷酸类似物，其中标记包括Cy3、Cy5或HCyC
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646。17.根据权利要求14所述的核苷酸类似物，其中标记是具有供体染料和受体染料的能量转移染料或能量转移染料簇，其中所述供体染料可以是量子点。18.根据权利要求17所述的核苷酸类似物，其中标记是能量转移染料，并且所述供体染料是荧光素、CyA、Cy3，并且所述受体染料是罗丹明110、R6G、TAMRA、ROX、Cy5、HCyC
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646、Alexa 647。19.根据权利要求14所述的核苷酸类似物，其中标记是锚定物，并且所述锚定物包括生物素、DBCO、TCO或四嗪，并且其中锚定物结合分子包括链霉亲和素、叠氮化物、四嗪或TCO并且进一步包括单一染料、单一染料簇或能量转移染料。20.根据权利要求19所述的核苷酸类似物，其中所述锚定物结合分子用有机染料或量子点标记。21.根据权利要求14到19中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于DTM的。22.根据权利要求14到19中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于偶氮基的。23.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求14所述的核苷酸类似物，其中所述四种不同的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物连接有不同的染料。24.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求14所述的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物中的两种核苷酸类似物包括第一染料，并且其余两种核苷酸类似物包括第二染料。25.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求14所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过相同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。26.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求14所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过不同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。27.一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；可切割接头包括DTM、偶氮基、2
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硝基苄基、烯丙基、叠氮基甲基或TCO衍生物或这些可切割接头中的多于一个可切割接头，包含其中一个可切割接头存在于所述碱基与阻断剂之间并且第二个不同的可切割接头存在于所述阻断剂与标记之间的特殊情况；阻断剂是包括无碱基糖或经修饰的核苷或其组合的2
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50个单体单元的核苷酸或寡核苷酸；并且阻断剂通过可切割接头连接到嘧啶(C、U)的5位置和去氮嘌呤(A、G、I)的7位置；其中阻断剂是在掺入之后防止另外的核苷酸或核苷酸类似物进一步掺入到引物链中的部分；并且标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于连接荧光染料的锚定物、用于连接荧光染料的锚定物簇、或锚定物和染料，其中所述标记连接到所述阻断剂。28.根据权利要求27所述的核苷酸类似物，其中标记选自荧光素、罗丹明、花青、ATTO和Dyomics染料。29.根据权利要求27所述的核苷酸类似物，其中标记包括Cy3、Cy5或HCyC
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646。30.根据权利要求27所述的核苷酸类似物，其中标记是具有供体染料和受体染料的能量转移染料或能量转移染料簇，其中所述供体染料可以是量子点。31.根据权利要求30所述的核苷酸类似物，其中标记是能量转移染料，并且所述供体染料是荧光素、CyA、Cy3，并且所述受体染料是罗丹明110、R6G、TAMRA、ROX、Cy5、HCyC
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646、Alexa 647。32.根据权利要求27所述的核苷酸类似物，其中标记是锚定物，并且所述锚定物包括生物素、DBCO、TCO或四嗪，并且其中锚定物结合分子包括链霉亲和素、叠氮化物、四嗪或TCO并且进一步包括单一染料、单一染料簇或能量转移染料。33.根据权利要求32所述的核苷酸类似物，其中所述锚定物结合分子用有机染料或量子点标记。34.根据权利要求27到32中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于DTM的。35.根据权利要求27到32中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于偶氮基的。36.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求27所述的核苷酸类似物，其中所述四种不同的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物连接有不同的染料。37.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求27所述的核苷酸类似物，其中所
述核苷酸类似物中的两种核苷酸类似物包括第一染料，并且其余两种核苷酸类似物包括第二染料。38.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求27所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过相同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。39.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求27所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过不同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。40.一种核苷酸类似物，其具有以下结构：其中：碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；并且R是可切割化学基团，所述可切割化学基团包括烷基DTM、偶氮基、2
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硝基苄基、烯丙基和叠氮基甲基衍生物。41.一种以下结构的核苷酸类似物：其中：碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；并且标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于染料连接的锚定物、用于染料连接的锚定物簇、或锚定物和染料。42.根据权利要求41所述的核苷酸类似物，其中标记选自荧光素、罗丹明、花青、ATTO和Dyomics染料。43.根据权利要求41所述的核苷酸类似物，其中标记包括Cy3、Cy5或HCyC
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646。44.根据权利要求41所述的核苷酸类似物，其中标记是具有供体染料和受体染料的能量转移染料或能量转移染料簇，其中所述供体染料可以是量子点。45.根据权利要求44所述的核苷酸类似物，其中标记是能量转移染料，并且所述供体染料是荧光素、CyA、Cy3，并且所述受体染料是罗丹明110、R6G、TAMRA、ROX、Cy5、HCyC
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646、Alexa 647。46.根据权利要求41所述的核苷酸类似物，其中标记是锚定物，并且所述锚定物包括生物素、DBCO、TCO或四嗪，并且其中锚定物结合分子包括链霉亲和素、叠氮化物、四嗪或TCO并
且进一步包括单一染料、单一染料簇或能量转移染料。47.根据权利要求46所述的核苷酸类似物，其中所述锚定物结合分子用有机染料或量子点标记。48.根据权利要求41到46中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于DTM的。49.根据权利要求41到46中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于偶氮基的。50.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求41所述的核苷酸类似物，其中所述四种不同的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物连接有不同的染料。51.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求41所述的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物中的两种核苷酸类似物包括第一染料，并且其余两种核苷酸类似物包括第二染料。52.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求41所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过相同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。53.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求41所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过不同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。54.一种以下结构的核苷酸类似物：其中碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物。55.一种以下结构的核苷酸类似物：其中：碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于染料连接的锚定物、用于染料连接的锚定物簇、或锚定物和染料；并且R包括甲基、乙基、丙基、叔丁基、芳基、烷基芳基。56.根据权利要求55所述的核苷酸类似物，其中标记选自荧光素、罗丹明、花青、ATTO和Dyomics染料。
57.根据权利要求55所述的核苷酸类似物，其中标记包括Cy3、Cy5或HCyC
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646。58.根据权利要求55所述的核苷酸类似物，其中标记是具有供体染料和受体染料的能量转移染料或能量转移染料簇，其中所述供体染料可以是量子点。59.根据权利要求58所述的核苷酸类似物，其中标记是能量转移染料，并且所述供体染料是荧光素、CyA、Cy3，并且所述受体染料是罗丹明110、R6G、TAMRA、ROX、Cy5、HCyC
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646、Alexa 647。60.根据权利要求55所述的核苷酸类似物，其中标记是锚定物，并且所述锚定物包括生物素、DBCO、TCO或四嗪，并且其中锚定物结合分子包括链霉亲和素、叠氮化物、四嗪或TCO并且进一步包括单一染料、单一染料簇或能量转移染料。61.根据权利要求60所述的核苷酸类似物，其中所述锚定物结合分子用有机染料或量子点标记。62.根据权利要求55到60中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于DTM的。63.根据权利要求55到60中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于偶氮基的。64.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求55所述的核苷酸类似物，其中所述四种不同的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物连接有不同的染料。65.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求55所述的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物中的两种核苷酸类似物包括第一染料，并且其余两种核苷酸类似物包括第二染料。66.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求55所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过相同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。67.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求55所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过不同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。68.一种以下结构的核苷酸类似物：其中：碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；并且R包括甲基、乙基、丙基、叔丁基、芳基、烷基芳基。69.一种以下结构的核苷酸类似物：
其中碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物。70.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；b)使所述核酸模板与两种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是：(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，以及(B)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的锚定物，其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头和所述3'
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OH基团能由相同的切割剂切割；或者(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'
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O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所提供的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物，其中所述锚定
物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述荧光标记相同的荧光标记；f)鉴定由于所述锚定物结合基团与步骤(b)的任何掺入的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物的结合而产生的任何荧光信号；g)用两种不同的经标记的核苷酸类似物重复步骤(b)
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(f)，所述两种不同的经标记的核苷酸类似物不同于来自步骤(b)的先前迭代的所述两种不同的经标记的核苷酸类似物；h)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记、锚定物或阻断基；i)从来自步骤(c)的任何掺入的核苷酸类似物中切割所述3'
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O阻断基；以及j)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(i)，由此获得所述核酸的序列。71.根据权利要求70所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求1到9或41到49中任一项所述的核苷酸类似物。72.根据权利要求70所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。73.根据权利要求70所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(III)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似物。74.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列，并且提供核酸聚合酶；b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物(A、C、T、G)接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，(C)两种不同的锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，其中每种类似物包括通过可切割接头与碱基连接的不同锚定物，其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，和(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸
的引物链中，以及(C)两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中每种类似物包括通过可切割接头与所述碱基连接的不同锚定物，其中所述可切割接头和所述3'
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O阻断基能由相同的切割剂切割；或者(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(C)两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中每种类似物包括通过可切割接头与所述碱基连接的不同锚定物，其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'
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O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；d)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与以下接触：(A)与步骤(b)的所述锚定物标记的核苷酸类似物中的仅一种锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物结合的锚定物结合基团，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物相同的荧光标记；以及(B)仅与剩余的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物结合的锚定物结合基团，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物相同的pH响应性荧光标记；f)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的锚定物标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；g)在所述pH响应性荧光标记不再具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗涤来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；h)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记、锚定物或阻断基；i)从来自步骤(c)的任何掺入的核苷酸类似物中切割所述3'
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O阻断基；以及j)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(i)，由此获得所述核酸的序列。75.根据权利要求74所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤
(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求1到9或41到49中任一项所述的核苷酸类似物。76.根据权利要求74所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。77.根据权利要求74所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(III)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似物。78.根据权利要求74所述的方法，其中所述具有pH响应性荧光的标记是HCyC
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646，并且具有pH不响应性荧光的标记是Cy5。79.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；b)使所述核酸模板与两种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是：(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，以及(B)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头和所述3'
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O阻断基能由相同的切割剂切割；或者(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'
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O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；e)用两种不同的经标记的核苷酸类似物重复步骤(b)
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(d)，所述两种不同的经标记的核苷酸类似物不同于来自步骤(b)的先前迭代的所述两种不同的经标记的核苷酸类似物；f)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；其中步骤(e)和(f)可以以相反的顺序执行；g)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记或阻断基；h)从来自步骤(c)的任何掺入的核苷酸类似物中切割所述3'
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O阻断基；以及i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，由此获得所述核酸的序列。80.根据权利要求79所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求1到9或41到49中任一项所述的核苷酸类似物。81.根据权利要求79所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。82.根据权利要求79所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(III)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似物。83.根据权利要求79所述的方法，其中所述具有pH响应性荧光的标记是HCyC
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646，并且具有pH不响应性荧光的标记是Cy5。84.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，(C)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的锚定物，以及(D)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过氨甲酰基
TCO接头与所述碱基连接的锚定物；(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述3'
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O阻断基和所述第一可切割接头能由相同的切割剂切割；或者(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中每种类似物上的所述荧光标记是相同的，其中每种类似物上的所述锚定物是相同的；c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'
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O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所提供的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述荧光标记相同的荧光标记；f)鉴定由于所述锚定物结合基团与步骤(b)的任何掺入的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物的结合而产生的任何荧光信号；g)使所掺入的核苷酸类似物与四嗪衍生物接触以点击所述氨甲酰基TCO接头的TCO部分以释放通过氨甲酰基TCO接头连接的任何标记或锚定物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述第一可切割接头和任何3'
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O阻断基的切割剂
接触；以及i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，由此获得所述核酸的序列。85.根据权利要求84所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求1到9或41到49中任一项所述的核苷酸类似物。86.根据权利要求84所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。87.根据权利要求84所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(III)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似物。88.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和第一锚定物，(C)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的所述第一锚定物和第二锚定物，以及(D)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的所述第二锚定物，其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和第一锚定物以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述可切割接头与所述碱基连接的所述第一锚定物和第二锚定物以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的所述第二锚定物以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头和所述3'
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O阻断基能由相同的切割剂
切割；或者(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记和第一锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的所述第一锚定物和第二锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的所述第二锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割，其中每种类似物上的所述荧光标记是相同的；c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'
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O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述第二锚定物，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的荧光标记相同的荧光标记；f)鉴定由于所述锚定物结合基团与步骤(b)的任何掺入的核苷酸类似物的所述锚定物的结合而产生的任何荧光信号；g)使所掺入的核苷酸类似物与第二锚定物结合基团接触，所述第二锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述第一锚定物并且包括使与所述锚定物结合基团连接到的所述核苷酸类似物连接的任何荧光标记的所述荧光信号猝灭的部分，并且鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述可切割接头和任何3'
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O阻断基的切割剂接触；以及i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，由此获得所述核酸的序列。89.根据权利要求88所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求1到9或41到49中任一项所述的核苷酸类似物。90.根据权利要求88所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。91.根据权利要求88所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(III)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似
物。92.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，(C)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物，以及(D)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的锚定物；(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'
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OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述3'
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OH阻断基和所述第一可切割接头能由相同的试剂切割；或者(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和通过所述阻断基远端的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚
定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过所述第...
【专利技术属性】
技术研发人员：靖岳，
申请(专利权)人：纽约市哥伦比亚大学信托人，
类型：发明
国别省市：
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