使用与固体表面结合的亲和配体分离和离析核酸制造技术

本发明专利技术公开了通过将靶标大分子(诸如DNA(双链或单链)、RNA(双链或单链)、信使RNA或其它低核苷酸或寡核苷酸)与结合于表面的亲和配体结合，从样品中离析和分离靶标大分子的方法。所述方法可用于色谱法或任何其他分离科学。学。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用与固体表面结合的亲和配体分离和离析核酸
[0001]相关应用的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年11月25日提交的美国临时专利申请号62/939,934的优先权。前述申请的全部内容通过引用整体并入本文。


[0003]本公开涉及使用结合到表面的特定选择的亲和配体从进料流或通常从样品中分离、离析和去除靶标大分子(诸如DNA和RNA)的方法。

技术介绍

[0004]色谱法(正如通常使用的)是一种分离样品混合物中各种成分的技术。在液相色谱系统中，依次将样品和洗脱液注入色谱分离柱。分离柱含有可与待分离样品的各种组分相互作用的填料或基质介质或材料。分离介质的组成取决于被引导通过其中的流体，以实现所需的分离。当样品和洗脱液通过分离介质时，由于不同的相互作用，样品的各种组分以不同的速率通过分离介质。这些组分在出口或分离介质的流出物中分离出来。
[0005]本领域已知各种类型的垂直和水平流分离柱。随着高效液相色谱的需要，开发了水平流型色谱柱。这种水平或径向流柱在例如美国专利号4,627,918和4,676,898中有描述。在水平或径向流型柱中，样品和洗脱流体通过分配器引入分离介质或基质的外周或周壁或表面，流体水平或径向向内通过分离介质到达中心或收集口，然后以不同的时间和不同的速率从柱中洗脱。
[0006]后来，开发了直接处理粗进料的色谱柱和方法，以分离生物活性物质，包括细胞/发酵收获物、组织提取物和血浆/血液。将大珠层析介质装入标准低压色谱柱中，用大孔筛(60
‑
180μm孔)代替端板筛。大孔防止色谱柱堵塞。由于颗粒大小较大，细胞物质在颗粒间腔中的珠之间流动，而可溶性产物被珠上的官能团捕获。
[0007]传统上，来自细胞培养/发酵收获的生物制品的下游处理需要两个主要操作：回收和纯化。回收涉及通过离心和/或微滤去除细胞和其他颗粒物质，以及初始的减容步骤，通常为超滤。由于常规色谱介质会被细胞碎片迅速污染，因此必须为纯化操作准备无颗粒进料。
[0008]在(治疗性)生物制品(诸如单克隆抗体)的某些纯化过程中，通过活细胞系统(哺乳动物、细菌、苔藓、藻类、植物等)产生样品/产物，并且产物或者由细胞分泌到进料流中，或者细胞被破碎以将产物释放到周围的液体中。然而，在所有这些生产系统中，产物不是作为单一组分纯产物提供的，而是作为所需产物和“污染物”的非常复杂的混合物，其中包括宿主细胞蛋白质(HCP)和基因组DNA以及RNA。
[0009]在纯化过程中，必须将纯化产物中的HCP和DNA/RNA去除至低于监管机构(诸如FDA)设定的限值水平。这种纯化常常通过阴离子离子交换法实现。在过滤和纯化含有蛋白质的样品期间，可能难以在不使目的蛋白质退变的情况下将蛋白质与其他细胞组分和宿主蛋白质分离，并且难以离析靶标蛋白质。一种常见的方法是通过沉淀；然而，这可能导致蛋
白质的变性或退变，这可能导致蛋白质功能的丧失。蛋白质的重折叠通常会导致活性丧失。快速蛋白质液相色谱(FPLC)是蛋白质纯化中常用的方法。在不必使用高压或侵蚀性pH缓冲液使蛋白质变性的情况下，可仅使用缓冲液与离析目的蛋白之间的特异性相互作用来纯化蛋白质。
[0010]仍然需要一种从进料流中去除和离析双链和单链DNA和RNA的系统。

技术实现思路

[0011]公开了从样品中分离靶标大分子的方法，包括以下步骤：选择将会与靶标大分子结合的亲和配体；将亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；将偶联的表面亲和配体放置于容器中；将含有靶标大分子的样品引入偶联的表面亲和配体，并使偶联的表面亲和配体与样品孵育一段停留时间，其中靶标大分子与亲和配体结合；以及将结合靶标大分子的偶联的表面亲和配体与从中去除了了靶标大分子的样品分离。任选地，所述方法包括收集基本上不含靶标大分子的洗脱液和/或从偶联的表面亲和配体洗脱和回收靶标大分子。
[0012]靶标大分子可以是双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA、双链信使RNA、单链信使RNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、病毒、含有低核苷酸(oligonucleotide)或寡核苷酸(oligonucleoside)的蛋白质、含有低核苷酸或寡核苷的脂质、其它低核苷酸或寡核苷酸、其任意片段或其任意组合。在某些实施方案中，所述亲和配体不结合样品中的蛋白质和/或为亚甲基蓝、Hoechst染料、苯并噻唑
‑
喹啉的花菁(cyanine)或苯并噁唑
‑
喹啉的花菁。所述表面可以是包括官能化基团的固体表面，例如珠、膜、颗粒、网、聚合物、玻璃、金属、陶瓷、二氧化硅、多糖、整体材(monolith)或色谱中用作树脂的任何其它材料。容器可以是色谱柱、碗、圆柱体、锥形器皿或桶。
[0013]还公开了从含有DNA和其它核酸的样品中离析和去除DNA的方法，以及从含有RNA和其它核酸的样品中离析和去除RNA的方法。这些方法包括以下步骤：选择将会与靶标DNA或RNA结合的亲和配体；将亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；将偶联的表面亲和配体放置于容器中；将所述样品引入偶联的表面亲和配体，并使偶联的表面亲和配体与所述样品孵育一段停留时间，其中靶标DNA或RNA与所述亲和配体结合；以及从去除了DNA或RNA的样品中分离与靶标DNA或RNA结合的偶联表面亲和配体。
附图说明
[0014]图1A和图1B是显示在两种浓度的MCMB珠状琼脂糖凝胶(30μg MCMB/mL凝胶和65μg MCMB/mL凝胶，MCMB＝单羧基亚甲蓝)中未处理和“超滤”的DNA(大小<50bp)，在两种浓度的MCMB珠状琼脂糖凝胶中结合的DNA百分比的对比条形图。图1A显示了与凝胶结合的DNA占加入的总DNA的％，图1B显示了凝胶结合DNA的能力(以μg DNA/mL凝胶计)。黑色＝MCMB
‑
琼脂糖；灰色＝对照(凝胶上不存在MCMB)；
[0015]图2A和2B是显示使用不同大小的DNA时凝胶结合DNA的能力的图：图2A＝与凝胶结合的DNA占加入的总DNA的％，图2B＝凝胶结合DNA的能力(以μg DNA/mL凝胶计)。白色＝天然琼脂糖珠w/o氨基；黑色＝氨基官能化琼脂糖珠；灰色＝DNA，浓度<50bp或<2000bp；
[0016]图3A
‑
3D是显示不同浓度(各50μL)的DNA通过1mL填充有天然琼脂糖珠的FPLC柱时
在260nm处的峰强度和电导率的图。这些图显示了四种不同DNA浓度下的结果：图3A＝3.3mg/mL，图3B＝1.5mg/mL，图3C＝0.33mg/mL，图3D＝0.15mg/mL；
[0017]图4是显示将DNA(2.5mg/mL TRIS，各50μL)加载到1mL填充有氨基琼脂糖珠或天然未改性的琼脂糖珠的FPLC柱上的结果(强度和电导率)的图；
[0018]图5是显示将DNA(2.5mg/mL TRIS，各50μL)加载到1mL填充本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.从样品中分离靶标大分子的方法，包括以下步骤：a.选择将会与靶标大分子结合的亲和配体；b.将所述亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；c.将所述偶联的表面亲和配体放置于容器中；d.将含有所述靶标大分子的样品引入所述偶联的表面亲和配体，并使所述偶联的表面亲和配体与所述样品孵育一段停留时间，其中所述靶标大分子与亲和配体结合；和e.将结合靶标大分子的所述偶联的表面亲和配体与从中去除了靶标大分子的样品分离。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标大分子是双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA、双链信使RNA、单链信使RNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、病毒、含有低核苷酸或寡核苷酸的蛋白质、含有低核苷酸或寡核苷酸的脂质、其它低核苷酸或寡核苷酸、其任意片段或其任意组合。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标大分子是DNA、RNA、其任意片段或其任意组合。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标大分子是双链DNA。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和配体是嵌入剂、小沟结合剂、大沟结合剂或其任意组合。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述亲和配体是选自由吖啶类、聚咪唑类、吲哚类、吡咯类、菲啶类、苯并噻唑
‑
喹啉或苯并噁唑
‑
喹啉的花菁、吩噁嗪类、吩噻嗪类、蒽醌类和呋喃香豆素类组成的组的化合物，并且其中所述化合物已被改性以包括能够将亲和配体结合到所述表面的连接基团。7.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：f.收集基本上不含所述靶标大分子的洗脱液。8.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：f.从所述偶联的表面亲和配体中洗脱并回收所述靶标大分子。9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)包括：i.选择将会与靶标大分子结合的嵌入剂、小沟结合剂、大沟结合剂或其任意组合；和ii.改性所述嵌入剂、小沟结合剂、大沟结合剂或其组合以包括连接基团，从而产生能够结合到表面的亲和配体。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和配体不结合样品中的任何蛋白质。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和配体是改性吩噻嗪、改性Hoechst染料、改性的苯并噻唑
‑
喹啉的花菁或改性的苯并噁唑
‑
喹啉的花菁。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述亲和配体是已被改性以包括以环氧基、羧基、卤化物或氨基为末端的间隔基的吩噻嗪、Hoechst染料、苯并噻唑
‑
喹啉的花菁或苯并噁唑
‑
喹啉的花菁。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述亲和配体是单羧基亚甲基蓝。14.根据权利要求12所述的方法，其中所述亲和配体是改性Hoechst染料，所述Hoechst染料选自由Hoechst 33258、Hoechst 33342和Hoechst 34580组成的组，并且所述亲和配体已被改性以包括以环氧基、羧基、卤化物或氨基为末端的间隔基，其中所述间隔基含有1
‑
30
个原子。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述亲和配体是左侧烷基氨基改性的Hoechst染料。16.根据权利要求14所述的方法，其中所述亲和配体是右侧烷基氨基改性的Hoechst染料。17.根据权利要求14所述的方法，其中所述亲和配体是改性单
‑
Hoechst染料。18.根据权利要求11所述的方法，其中所述亲和配体是已被改性以包括环氧基、羧基或以氨基或卤化物为末端的间隔基的改性的苯并噻唑
‑
喹啉的花菁或改性的苯并噁唑
‑
喹啉的花菁，并且其中所述间隔基包含1
‑
30个原子。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面是固体表面。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述固体表面是珠、膜、颗粒、网、聚合物、玻璃、金属、陶瓷、二氧化硅、多糖、整体材或色谱中用作树脂的任何其它材料。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：EMP生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：