【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用能量转移染料对边合成边测序
[0001]本申请要求于2019年4月2日提交的美国临时申请第62/828,031号的优先权，所述美国临时申请的内容特此通过引用并入。
[0002]在此整个申请中，引用了各种出版物和专利。这些参考的完整引文可以在权利要求书之前的说明书结尾处找到。这些出版物和专利的公开内容以其全文通过引用特此并入本申请中，以更全面地描述本专利技术所属领域的现状。
技术介绍
[0003]DNA测序是生物和医学研究中的基本工具，并且对于个性化医疗范式而言尤其重要。为了最终实现1,000美元基因组的目标，已经研究了各种新的DNA测序方法；主要的方法是边合成边测序(SBS)，这是一种在聚合酶反应期间确定DNA序列的方法(Hyman,1988；Ronaghi等人,1998；Ju等人,2003；Li,2003；Braslavsky等人,2003；Ruparel等人,2005；Margulies等人,2005；Ju等人,2006；Wu等人,2007；Guo等人,2008；Bentley等人,2008；Harris等人,2008；Eid等人,2009；Rothberg等人,2011)。
[0004]本文呈现了两类新型的基于能量转移的边合成边测序方法。
技术实现思路
[0005]本文中公开的专利技术提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
[0006]a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；
[0007]b)提供第一核酸聚合酶，并且如果荧光标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；b)提供第一核酸聚合酶，并且如果荧光标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶和所述核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述核苷酸类似物是：(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和荧光标记以及通过可切割接头附接到所述核苷酸类似物的所述碱基的封闭基团，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；或者(ii)荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物，所述荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头附接到所述核苷酸类似物的荧光标记以及在3'
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OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料，所述能量转移受体或供体染料针对附接到步骤b中所述核苷酸类似物的所述能量转移受体或供体染料；d)鉴定由于所述荧光标记的核苷酸类似物并入到所述引物上而产生的荧光信号；e)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；f)从步骤b)的任何并入的核苷酸类似物中切割所述标记和所述封闭基团；g)其中如果未在步骤d)中检测到荧光信号，则使用具有不同碱基的荧光标记的核苷酸类似物迭代地重复步骤b)到f)，直到并入所述荧光标记的核苷酸类似物为止；h)如果没有执行任选的追踪步骤e)，则任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；i)对所述核酸模板的每个核苷酸残基迭代地执行步骤b)到h)，由此确定所述核酸模板的序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物具有附接到所述碱基或在所述3'
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OH位置处的封闭基团。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核苷酸类似物上的染料是Cy5或ATTO647N，并且步骤c)的所述第二核酸聚合酶上的染料是Cy3，和/或其中所述碱基上的所述可切割接头是DTM。4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物的3'封闭基团是DTM或叠氮基甲基，并且使用THP进行所述切割。5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移供体染料，和/或其中所述核苷酸类似物和/或第二核酸聚合酶上的染料是染料簇。6.根据权利要求1到3和5中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物选
自图4和/或图9的核苷酸类似物中的任何一种核苷酸类似物。7.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物选自图5的核苷酸类似物中的任何一种核苷酸类似物。8.一种试剂盒，其包括用于执行根据权利要求1到7所述的方法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、可切割剂和其它反应缓冲液组分。9.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；b)提供第一核酸聚合酶和四种不同的标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的标记的核苷酸类似物是：(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头连接到所述碱基的封闭基团以及通过不可切割的或不同的可切割接头连接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中所述不同的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的每一种核苷酸类似物具有相同的荧光标记和不同的可切割接头，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；或者(ii)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头附接到所述碱基的荧光标记以及在3'
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OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中所述不同的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的每一种核苷酸类似物具有相同的荧光标记和不同的可切割接头，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料，所述能量转移受体或供体染料针对附接到并入步骤b中的所述核苷酸类似物的所述能量转移受体或供体染料；d)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；e)鉴定由于并入所述荧光标记的核苷酸类似物而产生的荧光共振能量转移(FRET)信号；f)使并入的标记的核苷酸类似物与切割所述可切割接头的切割剂接触，以从所述四种不同的标记的核苷酸类似物中的一种标记的核苷酸类似物中去除所述标记，其中所述切割剂不从剩余的标记的核苷酸类似物中切割所述可切割标记；g)补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定由于在步骤f)中执行的切割而导致的FRET信号的任何损失，以部分地或完全地鉴定所述并入的核苷酸；h)使用切割所述可切割接头的切割剂迭代地重复步骤f)和g)，以从不同的标记的核苷酸类似物中去除所述标记，其中所述切割剂不从剩余的标记的核苷酸类似物中切割所述标记；i)通过比较在步骤g)的多次迭代中获得的结果来确定在步骤b)中并入的所述标记的核苷酸类似物；以及
j)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的荧光标记，并且迭代地执行步骤b到j以获得所述核酸模板的序列。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物具有附接到所述碱基或在所述3'
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OH位置处的封闭基团。11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述核苷酸类似物上的染料是Cy5或ATTO647N，并且步骤c)的所述第二核酸聚合酶上的染料是Cy3，和/或其中染料包括染料簇。12.根据权利要求9到11中任一项所述的方法，其中步骤b)(i)的所述四种标记的核苷酸类似物各自包括将所述封闭基团连接到所述碱基的相同类型的可切割接头，并且所述四种标记的核苷酸类似物中的三种标记的核苷酸类似物包括连接所述封闭基团的远侧的所述荧光标记的不同的可切割接头，和/或其中所述可切割接头包括DTM、偶氮、烯丙基和2
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硝基苄基，并且所述切割剂分别包括THP、连二亚硫酸钠、Pd(0)和UV光(约340nm)。13.根据权利要求9到11中任一项所述的方法，其中步骤b)(ii)的所述四种标记的核苷酸类似物各自包括将所述荧光标记连接到所述碱基的不同可切割接头，并且其中所述切割所述可切割接头中的一个可切割接头的切割剂也切割在3'
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OH位置处的所述封闭基团，并且其中所述切割在3'
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OH处的所述封闭基团的切割剂接触在步骤f)的最终迭代中并入的标记的核苷酸类似物，和/或其中所述可切割接头包括DTM、偶氮、烯丙基和2
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硝基苄基，并且所述切割剂分别包括THP、连二亚硫酸钠、Pd(0)和UV光(约340nm)。14.根据权利要求9到13中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移供体染料，和/或其中所述四种标记的核苷酸类似物由在a)图5或b)图9中找到的那些标记的核苷酸类似物组成。15.一种试剂盒，其包括用于执行根据权利要求9到14中任一项所述的方法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、可切割剂和其它反应缓冲液组分。16.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；b)提供第一核酸聚合酶和四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述锚定物标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物是：(i)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头连接到所述碱基的封闭基团以及通过所述封闭基团远侧的不可切割接头连接到所述碱基的锚定物，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中每种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)具有不同的锚定物和相同的可切割接头；或者(ii)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头连接到所述碱基的锚定物以及在3'
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OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中每种不同的锚定物标记的
核苷酸类似物(A，C，G，T)具有与剩余的锚定物标记的核苷酸类似物不同的锚定物和相同的接头；c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中附接到所述聚合酶的所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；d)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；e)鉴定任何背景荧光共振能量转移(FRET)信号；f)使用对步骤b)的所述核苷酸类似物的四种锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子标记任何引物延伸产物，其中所述锚定物结合分子包括荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，所述能量转移供体或受体染料针对附接到所述第二核酸聚合酶的所述能量转移供体或受体染料；g)任选地补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定由于所述锚定物结合分子与并入步骤b)中的所述锚定物标记的核苷酸类似物结合而产生的任何荧光共振能量转移(FRET)信号；h)使用对剩余的锚定物标记的核苷酸类似物中的每一种锚定物标记的核苷酸类似物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子一个接一个地迭代地重复步骤f)和g)，其中相同的荧光染料附接到所有四个锚定物结合分子上；i)通过比较在步骤g)的多次迭代中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；j)使所述并入的与切割剂接触以从步骤b)的所述并入的核苷酸类似物中切割所述封闭基团和所述锚定物和荧光标记；以及迭代地执行步骤b)到j)以由此获得所述核酸模板的序列。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自a)步骤b)i)或b)步骤b)ii)的那些锚定物标记的核苷酸类似物，和/或其中所述染料各自包括染料簇。18.根据权利要求16或17所述的方法，其中步骤b)(i)的所述四种锚定物标记的核苷酸类似物各自包括通过相同的可切割接头附接到所述碱基的封闭基团、通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的不同锚定物，并且其中每种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物与不同的锚定物结合分子结合，和/或其中所述四种不同锚定物中的每一种锚定物独立地包括生物素、TCO、DBCO或四嗪中的一种，并且所述荧光标记的锚定物结合分子中的每一个荧光标记的锚定物结合分子分别独立地包括链霉亲和素、四嗪、叠氮基和TCO中的一种。19.根据权利要求16或17所述的方法，其中步骤b)ii)的所述四种锚定物标记的核苷酸类似物各自包括通过相同的可切割接头附接到所述碱基的不同锚定物，并且其中每种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物与不同的锚定物结合分子结合，和/或其中所述四种不同锚定物中的每一种锚定物独立地包括生物素、TCO、DBCO和四嗪中的一种，并且其中所述荧光标记的锚定物结合分子中的每一个荧光标记的锚定物结合分子分别独立地包括链霉亲和素、四嗪、叠氮基和TCO中的一种。20.根据权利要求16到19中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移供体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移受体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移供体染料，和/或其中所述锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是a)图6或b)图10的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分
子。21.一种试剂盒，其包括用于执行根据权利要求16到20所述的方法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、标记的锚定物结合分子、可切割剂和其它反应缓冲液组分。22.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；b)提供第一核酸聚合酶和四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述锚定物标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种不同的锚定物标记的核苷酸类似物是：(i)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基和通过相同的可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，其中所述不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的两种锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，并且剩余的两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧，并且所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物中的每一种锚定物标记的核苷酸类似物的锚定物通过相同的可切割接头附接到所述封闭基团的远侧；或者(ii)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物各自包括碱基、通过可切割接头附接到所述碱基的锚定物以及在3'
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OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，其中所述不同的锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)中的两种锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，并且剩余的两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括相同的锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的两种锚定物标记的核苷酸类似物的可切割接头相同，并且其中剩余的两种锚定物标记的核苷酸类似物的可切割接头是相同和不同的可切割基团；c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中附接到所述聚合酶的所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；d)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；e)鉴定任何背景荧光共振能量转移(FRET)信号；f)使用对步骤b)的所述核苷酸类似物的锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子标记任何引物延伸产物，其中所述锚定物结合分子包括荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，所述能量转移供体或受体染料针对附接到所述第二核酸聚合酶的所述能量转移供体或受体染料；g)鉴定由于步骤f)中的所述标记而产生的新生成的FRET信号，以部分地鉴定步骤b)中的并入的核苷酸类似物；h)使用对所述第二锚定物具有特异性的第二荧光标记的锚定物结合分子重复步骤e)和f)；i)使用特异性可切割剂从所述荧光标记的核苷酸中切割所述染料，所述特异性可切割剂切割所述可切割接头中的一个可切割接头但不切割任何剩余接头；
j)任选地补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定由于在步骤i)中执行的切割而导致的FRET信号的损失；k)通过比较在步骤g)和j)中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；l)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割剩余的锚定物和荧光标记；以及迭代地执行步骤b)到l)以获得所述核酸模板的序列。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自a)步骤b)i)或b)步骤b)ii)的那些锚定物标记的核苷酸类似物，和/或其中所述染料包括染料簇。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述四种锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)包括两个不同的可切割接头和两种不同的锚定物(锚定物1和锚定物2)，一个可切割接头(可切割接头1)位于所述封闭基团与所有四种所述锚定物标记的核苷酸类似物的碱基之间，并且不同的可切割接头(可切割接头2)位于所述封闭基团的远侧，从而将所述锚定物连接到所述核苷酸类似物中的两种核苷酸类似物的封闭基团，由此产生一组4种核苷酸或核苷酸类似物，一种由可切割接头1与锚定物1组成，一种由可切割接头1与锚定物2组成，一种由可切割接头1、可切割接头2和锚定物1组成，并且最后一种由可切割接头1、可切割接头2和锚定物2组成，其中可切割接头2的切割和荧光信号的检测在可切割接头1的最终切割之前进行，和/或其中所述可切割接头包括DTM和偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素和TCO，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。25.根据权利要求23所述的方法，其中所述四种锚定物标记的核苷酸类似物(A，C，G，T)包括2个不同的可切割接头和2种不同的锚定物(锚定物1和锚定物2)，其中一个可切割接头(可切割接头1)将核苷酸类似物的碱基连接到锚定物，另一个可切割接头(可切割接头2)将核苷酸类似物的碱基连接到锚定物，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头1和锚定物1，另一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头1和锚定物2，另一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头2和锚定物1，并且最后一种锚定物标记的核苷酸类似物具有可切割接头2和锚定物2，由此产生一组4种核苷酸类似物，其中能够切割可切割接头1的药剂也去除3'
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OH封闭基团，并且其中在切割可切割接头1之前执行可切割接头2的切割和信号的确定，和/或其中所述可切割接头独立地包括DTM或偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素和TCO，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。26.根据权利要求22到25中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移供体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的锚定物结合分子上的染料是能量转移受体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移供体染料，和/或其中所述锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是a)图7或b)图11的那些锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子。27.一种试剂盒，其包括用于执行根据权利要求22到26所述的方法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、标记的锚定物结合分子、可切割剂和其它反应缓冲液组分。28.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；b)提供第一核酸聚合酶、四种不同的标记的核苷酸类似物(A，C，T，G)，并且如果所述核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶以及所述核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述四种标记的核苷酸类似物是：(i)两种不同的荧光标记的核苷酸类似物，所述两种不同的荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，其中所述荧光标记的核苷酸类似物中的一种荧光标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，并且其中剩余的荧光标记的核苷酸类似物包括通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；以及两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头连接到所述碱基的封闭基团，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过所述第二可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的锚定物，并且其中剩余的锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过不可切割接头附接到所述封闭基团的远侧的相同锚定物；或者(ii)两种不同的荧光标记的核苷酸类似物，所述两种不同的荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和在3'
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OH位置处的封闭基团，其中所述荧光标记的核苷酸类似物中的一种荧光标记的核苷酸类似物包括通过第一可切割接头附接到所述碱基的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料，并且其中剩余的荧光标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头附接到所述碱基的荧光标记，其中所述荧光标记是能量转移供体或受体染料；以及两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和在3'
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OH位置处的封闭基团，其中所述锚定物标记的核苷酸类似物中的一种锚定物标记的核苷酸类似物包括通过所述第一可切割接头连接到所述碱基的锚定物，并且其中剩余的锚定物标记的核苷酸类似物包括通过第二可切割接头连接到所述碱基的相同锚定物；c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中附接到所述聚合酶的所述荧光标记是用于所述荧光标记的核苷酸类似物的荧光标记的能量转移供体或受体染料；d)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；e)鉴定由于并入任何荧光标记的核苷酸类似物而产生的荧光共振能量转移(FRET)信号；f)用对所述锚定物中的一种锚定物具有特异性的荧光标记的锚定物结合分子来标记
锚定物附接的引物延伸产物，其中所述荧光标记与所述荧光标记的核苷酸类似物上的荧光标记相同；g)任选地补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定任何新生成的FRET信号以部分地鉴定由于在步骤f)中执行的标记而并入的核苷酸；h)使用特异性切割剂从所述荧光标记的核苷酸中切割所述染料，所述切割剂切割所述接头中的一个接头但不切割任何剩余接头；i)任选地补充所述第二核酸聚合酶并且鉴定由于在步骤g)中执行的切割而导致的FRET信号的任何损失；j)通过比较在步骤g)和i)中获得的结果来确定并入的特异性核苷酸类似物；k)切割所述封闭基团，并且同时从所述延伸的引物中切割任何剩余的锚定物和荧光标记；以及迭代地执行步骤b)到k)以获得所述核酸模板的序列。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述四种锚定物标记的核苷酸类似物是来自a)步骤b)i)或b)步骤b)ii)的那些锚定物标记的核苷酸类似物，和/或其中所述染料包括染料簇。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述四种标记的核苷酸类似物包括2个不同的可切割接头和2种不同的锚定物，一个可切割接头(可切割接头1)位于所述封闭基团与所有四种所述核苷酸或核苷酸类似物之间，并且不同的可切割接头(可切割接头2)位于所述碱基与所述锚定物之间，但在所述核苷酸或核苷酸类似物中的两种核苷酸或核苷酸类似物的封闭基团的远侧，由此产生一组4种核苷酸或核苷酸类似物，一种包括可切割接头1和锚定物1，一种包括可切割接头1与锚定物2，一种包括可切割接头1、可切割接头2和锚定物1，并且最后一种包括可切割接头1、可切割接头2和锚定物2，其中可切割接头2的切割和荧光信号的检测在可切割接头1的最终切割之前进行，和/或其中可切割接头1包括DTM，可切割接头2包括偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素(锚定物1)和TCO(锚定物2)，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。31.根据权利要求29所述的方法，其中所述四种标记的核苷酸类似物2个不同的可切割接头和2种不同的锚定物，第一类型的可切割接头位于所述核苷酸或核苷酸类似物中的一种核苷酸或核苷酸类似物与所述锚定物中的一种锚定物之间，所述第一类型的可切割接头位于第二核苷酸类似物与第二类型的锚定物之间，第二类型的可切割接头位于第三核苷酸类似物与第一锚定物之间，并且所述第二类型的可切割接头位于第四核苷酸类似物与第二锚定物之间，由此产生一组4种核苷酸或核苷酸类似物，其中所述第一类型的可切割接头的切割也能够去除3'
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OH封闭基团，并且其中在切割所述第一类型的可切割接头之前执行所述第二类型的可切割接头的切割和信号的确定，和/或其中所述可切割接头包括DTM和偶氮，所述切割剂分别包括THP和连二亚硫酸钠，所述锚定物包括生物素和TCO，并且所述荧光标记的锚定物结合分子分别包括链霉亲和素和四嗪。32.根据权利要求28到31中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的锚定物结合分子和荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的锚定物结合分子和所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移供体
染料，和/或其中所述锚定物标记的核苷酸类似物和对应的锚定物结合分子是a)图8或b)图12的那些锚定物标...
【专利技术属性】
技术研发人员：靖岳，
申请(专利权)人：纽约市哥伦比亚大学信托人，
类型：发明
国别省市：
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