一种人脐带间充质干细胞的制备方法技术

本发明专利技术涉及人脐带间充质干细胞的制备技术领域，尤其涉及一种人脐带间充质干细胞的制备方法，针对当前现有的人脐带间充质干细胞的制备技术存在制备过程没有严格的处理步骤导致间充质干细胞制备的成功率较低的问题，现提出如下方案，其中包括以下步骤：S1：对象选取，S2：标本采集，S3：进行检测，S4：进行处理，S5：进行制备，S6：细胞检测，S7：后续处理，本发明专利技术的目的是通过执行严格的无菌步骤以及干细胞培养过程，提高了间充质干细胞制备的成功率，同时通过对采集的样本进行检测，降低了因污染导致间充质干细胞制备失败的可能性。间充质干细胞制备失败的可能性。间充质干细胞制备失败的可能性。

【技术实现步骤摘要】
一种人脐带间充质干细胞的制备方法


[0001]本专利技术涉及人脐带间充质干细胞的制备
，尤其涉及一种人脐带间充质干细胞的制备方法。

技术介绍

[0002]干细胞是一群具有自我更新和分化潜能的细胞，根据发育状态可以分为胚胎干细胞和成体干细胞，其中间充质干细胞(MSCs)是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞在体外可以分化诱导为骨、脂肪、神经等多种组织细胞，具有向受损组织归巢并且修复、重建受损或病变组织器官的特点。此外，MSCs还具备免疫原性低、移植成活率高、细胞治疗效果好等特点，因此成为当前干细胞研究的热点。目前临床应用MSCs的主要来源为骨髓、脐带，但成人骨髓中MSCs数量较少病毒感染率高、免疫原性强且取材较复杂，限制其应用。近年研究显示，人脐带中存大量的MSCs，与其他来源相比，脐带间充质干细胞(UC
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MSCs)以更加易于获得，对母子均无损伤，且冻存和复苏后细胞的生物学性状无明显变化，使其成为细胞治疗中的理想细胞而逐渐替代骨髓来源MSCs。
[0003]但是目前现有的人脐带间充质干细胞的制备技术存在制备过程没有严格的处理步骤导致间充质干细胞制备的成功率较低的问题，因此，我们提出一种人脐带间充质干细胞的制备方法用于解决上述问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决目前现有的人脐带间充质干细胞的制备技术存在制备过程没有严格的处理步骤导致间充质干细胞制备的成功率较低等问题，而提出的一种人脐带间充质干细胞的制备方法。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0006]一种人脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0007]S1：对象选取：由专业人员选取健康产妇分娩的足月顺产儿脐带；
[0008]S2：标本采集：由专业人员对选取的健康产妇分娩的足月顺产儿进行脐带标本采集；
[0009]S3：进行检测：由专业人员对采集到的脐带标本中含有的脐带血进行检测；
[0010]S4：进行处理：由专业人员对采集到的可用新鲜脐带进行处理；
[0011]S5：进行制备：由专业人员进行制备脐带间充质干细胞；
[0012]S6：细胞检测：由专业人员采用流式细胞仪检测细胞表面标志物；
[0013]S7：后续处理：由专业人员对培养出的脐带间充质干细胞检测进行保存及复苏；
[0014]优选的，所述S1中，由专业人员选取健康产妇分娩的足月顺产儿脐带，其中进行选取时筛去妊娠不足32周、羊膜破水超过12小时后分娩、分娩时产妇体温超过38℃、羊水中有胎类、孕妇贫血、胎儿呼吸窘迫征、分娩前经羊水细胞和胎盘绒毛活检证明有遗传性疾病、产妇有肝病史、肝功能异常以及其他病史、早产称、畸形儿、死胎；
[0015]优选的，所述S2中，由专业人员对选取的健康产妇分娩的足月顺产儿进行脐带标本采集，其中进行脐带标本采集时采集的时间点为新生儿娩出且胎盘尚未娩出时，且从进行脐带标本采集至脐带标本采集完毕时间不超过分娩后5分钟，进行脐带标本采集时是在新生儿娩出后，在距脐部5
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7cm处用止血钳夹住脐带两端，并于两钳中间进行断脐，进行脐带标本采集前由专业人员对产妇的产检报告进行阅读，并在产妇分娩初期对产妇腹中胎儿进行观测，将产检报告阅读结果与观测结果进行对比，并通过对比结果进行判断，通过判断结果进行处理，其中对比结果显示产检报告阅读结果与观测结果显示胎儿数目一致则判断为正常，对比结果显示产检报告阅读结果与观测结果显示胎儿数目不一致则判断为异常，且判断为正常则由专业人员对胎儿数目进行识别，判断为异常则由专业人员对真实胎儿数目进行识别，并通过识别结果进行处理，识别结果显示胎儿数目等于一则由专业人员在第一胎娩出后进行脐带标本采集，识别结果显示胎儿数目大于一则由专业人员在最后一胎娩出后进行脐带标本采集，且识别结果显示胎儿数目大于一时可进行多个脐带标本采集，其中进行多个脐带标本采集时不同胎儿连接的脐带采用单独无菌袋进行盛装，且按胎儿娩出顺序对无菌袋进行标记；
[0016]优选的，所述S3中，由专业人员对采集到的脐带标本中含有的脐带血进行检测，其中进行检测时检测内容包括血红蛋白、血型、丙氨酸氨基转移酶、乙肝病毒表面抗原、丙肝病毒抗体、艾滋病、弓形体抗体、梅毒血清学检测，并按血液管理有关规定进行血液质量检测及做无菌试验，并通过检测结果进行判断，通过判断结果进行处理，其中检测结果显示检测内容均正常且脐带血无菌则判断为采集到的脐带标本可用，其余结果均判断为采集到的脐带标本不可用，且判断结果为采集到的脐带标本可用则由专业人员对所述脐带标本进行处理，判断结果为所述脐带标本不可以则由专业人员重新采集新的脐带标本；
[0017]优选的，所述S4中，由专业人员对采集到的可用新鲜脐带进行处理，其中进行处理时由专业人员采用生理盐水洗去脐带残留血液，并采用消毒剪刀将脐带剪切成2
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3cm长的小段，剪切完成后再次漂洗，其中进行漂洗时采用无菌水进行漂洗，并由专业人员对一次漂洗后的无菌水溶液进行观测，通过观测结果进行判断，并通过判断结果进行处理，其中观测结果显示一次漂洗后的无菌水溶液表面无血迹残留则判断为漂洗完成，观测结果显示一次漂洗后的无菌水溶液表面有血迹残留则判断为漂洗未完成，且判断结果为漂洗完成则由专业人员将所述小段脐带进行纵行剖开，并剔除1条脐静脉、两条脐动脉，同时剥离华通胶，判断结果为漂洗未完成则由专业人员进行二次漂洗，并对二次漂洗后的无菌水溶液进行观测，通过观测结果进行判断、处理，直至判断结果为漂洗完成则由专业人员将所述小段脐带进行纵行剖开，并剔除1条脐静脉、两条脐动脉，同时剥离华通胶；
[0018]优选的，所述S5中，由专业人员用眼科剪将华通胶剪碎成1mm2的小组织块，并将剪好的小组织块转移至细胞培养瓶中进行培养制备脐带间充质干细胞，加入含有体积分数为10％的FBS、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM/F12培养液，将细胞培养瓶放置于环境中含有5％CO2且温度在37℃的培养箱中进行静置培养，并由专业人员采用倒置显微镜每天观察细胞生长情况，且1周后进行首次换液，首次换液完成后采用定期换液，其中定期换液时换液间隔为3
‑
4d，待细胞长至80
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90％融合时用胰蛋白酶/EDTA消化液进行消化传代，并由专业人员通过显微镜进行实时观测，通过观测结果控制消化时间；
[0019]优选的，所述S6中，由专业人员采用流式细胞仪检测细胞表面标志物，其中进行细
胞表面标志物检测时先分别取原代、第3代、第6代、第9代细胞，通过观察达到80
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90％融合时采用胰蛋白酶/EDTA消化液进行消化，并制成细胞悬液，分别向所述制成的细胞悬液中加人鼠抗人单克隆抗体CD29
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PE、CD44
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PE、CD90
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PE、CD105
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PE、CD34
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PE、CD45...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：对象选取：由专业人员选取健康产妇分娩的足月顺产儿脐带；S2：标本采集：由专业人员对选取的健康产妇分娩的足月顺产儿进行脐带标本采集；S3：进行检测：由专业人员对采集到的脐带标本中含有的脐带血进行检测；S4：进行处理：由专业人员对采集到的可用新鲜脐带进行处理；S5：进行制备：由专业人员进行制备脐带间充质干细胞；S6：细胞检测：由专业人员采用流式细胞仪检测细胞表面标志物；S7：后续处理：由专业人员对培养出的脐带间充质干细胞检测进行保存及复苏。2.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述S1中，由专业人员选取健康产妇分娩的足月顺产儿脐带，其中进行选取时筛去妊娠不足32周、羊膜破水超过12小时后分娩、分娩时产妇体温超过38℃、羊水中有胎类、孕妇贫血、胎儿呼吸窘迫征、分娩前经羊水细胞和胎盘绒毛活检证明有遗传性疾病、产妇有肝病史、肝功能异常以及其他病史、早产称、畸形儿、死胎。3.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述S2中，由专业人员对选取的健康产妇分娩的足月顺产儿进行脐带标本采集，其中进行脐带标本采集时采集的时间点为新生儿娩出且胎盘尚未娩出时，且从进行脐带标本采集至脐带标本采集完毕时间不超过分娩后5分钟，进行脐带标本采集时是在新生儿娩出后，在距脐部5
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7cm处用止血钳夹住脐带两端，并于两钳中间进行断脐。4.根据权利要求3所述的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，进行脐带标本采集前由专业人员对产妇的产检报告进行阅读，并在产妇分娩初期对产妇腹中胎儿进行观测，将产检报告阅读结果与观测结果进行对比，并通过对比结果进行判断，通过判断结果进行处理，其中对比结果显示产检报告阅读结果与观测结果显示胎儿数目一致则判断为正常，对比结果显示产检报告阅读结果与观测结果显示胎儿数目不一致则判断为异常，且判断为正常则由专业人员对胎儿数目进行识别，判断为异常则由专业人员对真实胎儿数目进行识别，并通过识别结果进行处理，识别结果显示胎儿数目等于一则由专业人员在第一胎娩出后进行脐带标本采集，识别结果显示胎儿数目大于一则由专业人员在最后一胎娩出后进行脐带标本采集，且识别结果显示胎儿数目大于一时可进行多个脐带标本采集，其中进行多个脐带标本采集时不同胎儿连接的脐带采用单独无菌袋进行盛装，且按胎儿娩出顺序对无菌袋进行标记。5.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述S3中，由专业人员对采集到的脐带标本中含有的脐带血进行检测，其中进行检测时检测内容包括血红蛋白、血型、丙氨酸氨基转移酶、乙肝病毒表面抗原、丙肝病毒抗体、艾滋病、弓形体抗体、梅毒血清学检测，并按血液管理有关规定进行血液质量检测及做无菌试验，并通过检测结果进行判断，通过判断结果进行处理，其中检测结果显示检测内容均正常且脐带血无菌则判断为采集到的脐带标本可用，其余结果均判断为采集到的脐带标本不可用，且判断结果为采集到的脐带标本可用则由专业人员对所述脐带标本进行处理，判断结果为所述脐带标本不可以则由专业人员重新采集新的脐带标本。6.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述S4中，由专业人员对采集到的可用新鲜脐带进行处理，其中进行处理时由专业人员采用生理
盐水洗去脐带残留血液，并采用消毒剪刀将脐带剪切成2
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3cm长的小段，剪切完成后再次漂洗，其中进行漂洗时采用无菌水进行漂洗，并由专业人员对一次漂洗后的无菌水溶液进行观测，通过观测结果进行判断，并通过判断结果进行处理，其中观测结果显示一...

【专利技术属性】
技术研发人员：王安成，陈丽晶，
申请(专利权)人：玺瑞生命科学深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：