一种体外规模化培养扩增间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种体外规模化培养扩增间充质干细胞的方法，包括如下步骤：S1：准备脐带原料，并使用清洗液对脐带原料进行清洗；S2：将脐带原料切碎成细碎组织，并放入培养瓶中；S3：依次向每个培养瓶中添加培养基；S4：将培养瓶放入培养箱中，并向培养箱通入CO2；S5：对培养瓶中溶液进行换液；S6：将培养瓶中加入分层液进行溶液的分层；S7：对分层后的溶液进行离心分离，得到充质干细胞；S8：对充质干细胞进行液氮冻存，需要时再进行复苏；所选培养基的配方能够选择性的促进间充质干细胞体外培养中的生长和分化，并为其达到最理想营养平衡状态提供数量上和质量上的保证，培养箱以及培养瓶均经过灭菌处理。经过灭菌处理。

【技术实现步骤摘要】
一种体外规模化培养扩增间充质干细胞的方法


[0001]本专利技术属于间充质干细胞培养
，具体涉及一种体外规模化培养扩增间充质干细胞的方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建，间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。由于它分化的组织类型十分广泛，因此临床应用价值不菲，间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。此外，间充质干细胞在神经系统修复及更多方面具有长远的发展前景，间充质干细胞是一种早期未分化的细胞，它具有一切干细胞的特征，具有自我复制、自我分裂、自我更新、多向分化的功能。间充质干细胞主要存在于骨髓腔中，同时也存在于骨小梁等其他结缔组织中。间充质干细胞对造血干细胞的正常发育成熟发挥着重要的作用，间充质干细胞提供了正常造血干细胞生长发育所需要的环境和各种刺激因子。在临床上通过注射间充质干细胞，经常应用于血液系统疾病、结缔组织病以及心血管系统疾病和脑血管系统疾病的治疗，比如在骨髓移植的患者，同时注射间充质干细胞能够更快的促进造血功能的重建。另外间充质干细胞在治疗神经损伤、心肌梗死损伤等也有一定的作用，取得了较好的治疗效果。
[0003]目前常规体外培养扩增间充质干细胞的方法多是采用从脐带中分离培养得到，而制备的方法通常是组织块贴壁法以及酶消化法。使用酶消化法一般采用胶原蛋白酶和胰蛋白酶消化脐带沃顿胶组织后进行大量培养，在这个方法中胰蛋白酶是通过离解细胞间的粘蛋白、糖蛋白而影响细胞骨架从而使细胞分离，对细胞间质的蛋白成分及细胞膜蛋白均有较强的破坏作用，因此造成分离到的干细胞易由于受到损伤而造成活性不佳，难以扩增出理想数目和活性的间充质干细胞，同时常规体外培养扩增间充质干细胞的方法通常一次性培养细胞较少，难以达到规模化。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种体外规模化培养扩增间充质干细胞的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的目前常规体外培养扩增间充质干细胞的方法多是采用从脐带中分离培养得到，而制备的方法通常是组织块贴壁法以及酶消化法。使用酶消化法一般采用胶原蛋白酶和胰蛋白酶消化脐带沃顿胶组织后进行大量培养，在这个方法中胰蛋白酶是通过离解细胞间的粘蛋白、糖蛋白而影响细胞骨架从而使细胞分离，对细胞间质的蛋白成分及细胞膜蛋白均有较强的破坏作用，因此造成分离到的干细胞哟一由于受到损伤而造成活性不佳，难以扩增出理想数目和活性的间充质干细胞，同时常规体外培养扩增间充质干细胞的方法通常一次性培养细胞较少，难以达到规模化的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种体外规模化培养扩增间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
[0006]S1：准备脐带原料，并使用清洗液对脐带原料进行清洗；
[0007]S2：将脐带原料切碎成细碎组织，并放入培养瓶中；
[0008]S3：依次向每个培养瓶中添加培养基；
[0009]S4：将培养瓶放入培养箱中，并向培养箱通入CO2；
[0010]S5：对培养瓶中溶液进行换液；
[0011]S6：将培养瓶中加入分层液进行溶液的分层；
[0012]S7：对分层后的溶液进行离心分离，得到充质干细胞；
[0013]S8：对充质干细胞进行液氮冻存，需要时再进行复苏。
[0014]本专利技术中，优选的，所述清洗液为生理盐水，所述培养瓶的数量为六个。
[0015]本专利技术中，优选的，所述培养基选择氨基酸、维生素、有机化合物、无机化合物、激素、生长因子以及微量矿物质。
[0016]本专利技术中，优选的，所述培养箱内控制温度为37℃，所述CO2的浓度为5％。
[0017]本专利技术中，优选的，所述培养第五天后进行第一次换液，第一次换液为全量换液，全量换液后七天进行半量换液，往后三天进行一次全量换液，直到细胞融合度达到40％
‑
50％。
[0018]本专利技术中，优选的，所述分层液为一种密度介于1.075
‑
1.092g/ml之间而近于等渗的溶液，通过分层液进行密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
[0019]本专利技术中，优选的，所述使用液氮对冻存盒以及冻存管内的充质干细胞进行保存，复苏时，将细胞置于37℃的水浴中，保持1
‑
2分钟完成复苏。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：所选培养基是经灭菌的液体培养基，培养基缓冲体系为重碳酸盐，在含5％CO2的细胞培养箱中平衡后pH值为7.4。该培养基的配方能够选择性的促进间充质干细胞体外培养中的生长和分化，并为其达到最理想营养平衡状态提供数量上和质量上的保证，培养箱以及培养瓶均经过灭菌处理，整个培养过程能够达到无菌、无污染的状态。所得细胞活性佳、受损率较低，同时能够扩增出理想数目和活性的间充质干细胞。
附图说明
[0021]图1为本专利技术的步骤图；
[0022]图2为本实用培养基的结构组成图。
具体实施方式
[0023]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0024]请参阅图1
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图2，本专利技术提供如下技术方案：一种体外规模化培养扩增间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
[0025]S1：准备脐带原料，并使用清洗液对脐带原料进行清洗；
[0026]S2：将脐带原料切碎成细碎组织，并放入培养瓶中；
[0027]S3：依次向每个培养瓶中添加培养基；
[0028]S4：将培养瓶放入培养箱中，并向培养箱通入CO2；
[0029]S5：对培养瓶中溶液进行换液；
[0030]S6：将培养瓶中加入分层液进行溶液的分层；
[0031]S7：对分层后的溶液进行离心分离，得到充质干细胞；
[0032]S7：对充质干细胞进行液氮冻存，需要时再进行复苏。
[0033]本实施例中，优选的，原料选择有机质丰富的草炭土、腐植酸、黄腐酸、豆粕，原料的混合配比为3份草炭土、3份腐植酸、1份黄腐酸和2份豆粕。
[0034]本实施例中，优选的，清洗液为生理盐水，所述培养瓶的数量为六个。
[0035]本实施例中，优选的，所述培养基选择氨基酸、维生素、有机化合物、无机化合物、激素、生长因子以及微量矿物质。
[0036]本实施例中，优选的，所述培养箱内控制温度为37℃，所述CO2的浓度为5％。
[0037]本实施例中，优选的，所述培养第五天后进行第一次换液，第一次换液为全量换液，全量换液后七天进行半量换液，往后三天进行一次全量换液，直到细胞融合度达到40％
‑
50％。
[0038]本实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外规模化培养扩增间充质干细胞的方法，包括如下步骤：S1：准备脐带原料，并使用清洗液对脐带原料进行清洗；S2：将脐带原料切碎成细碎组织，并放入培养瓶中；S3：依次向每个培养瓶中添加培养基；S4：将培养瓶放入培养箱中，并向培养箱通入CO2；S5：对培养瓶中溶液进行换液；S6：将培养瓶中加入分层液进行溶液的分层；S7：对分层后的溶液进行离心分离，得到充质干细胞；S8：对充质干细胞进行液氮冻存，需要时再进行复苏。2.根据权利要求1所述的一种体外规模化培养扩增间充质干细胞的方法，其特征在于：所述清洗液为生理盐水，所述培养瓶的数量为六个。3.根据权利要求1所述的一种体外规模化培养扩增间充质干细胞的方法，其特征在于：所述培养基选择氨基酸、维生素、有机化合物、无机化合物、激素、生长因子以及微量矿物质。4.根据权利要求1所述的一种体外规模化培养扩增间充质干细胞的方法，其特征在于：所述培养箱内...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玮，董向涛，邓姗姗，张敬言，郝连甲，杨光宇，
申请(专利权)人：河北三臧生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：