一种猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法技术

本发明专利技术属于细胞培养技术领域，公开了一种猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，利用PBS冲洗腿骨外部，利用全骨髓干细胞培养液采集骨髓；将冲洗后的全骨髓干细胞培养液液移至离心管中进行离心；加红细胞裂解液，吹打，静置；将静置后的液体进行离心，收集细胞层；向细胞沉淀中加入培养液，每三天更换一半培养基，第9天对细胞进行传代。本发明专利技术采用优化操作来分离BMSCs，在骨髓液中加入红细胞裂解液，使得骨髓液中占比多的红细胞破碎裂解，提高细胞纯度；采用半换液的方法，通过少量多次的手段以保留更多的细胞。使用本发明专利技术的优化后的细胞分离培养方法，可以提高BMSCs的分离效率和纯度，避免对其活性的影响，操作简便，成本低。成本低。成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法


[0001]本专利技术属于细胞培养
，尤其涉及一种猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法。

技术介绍

[0002]目前，间充质干细胞(MSCs)可从各种组织来源分离出来，包括骨髓、脂肪、胎盘、结缔组织等，其中骨髓来源的MSCs被称为骨髓间充质干细胞(bone marrow
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derived mesenchymal stem cells，BMSCs)，具有免疫调节功能和向多种细胞分化的能力，还有高增殖率的特点，具有广阔的研究和应用前景。传统的全骨髓培养法是利用BMSCs在低血清条件下具有良好的粘附能力，并在更换培养液时清除非附着的杂细胞，以实现BMSCs的分离纯化；Percoll和Ficoll浓度梯度离心法是根据BMSCs浓度与其他各组分不同从而进行分离；还有根据细胞表面标记物，采用流式细胞仪对BMSCs进行分选，流式细胞仪分选可得到高纯度的BMSCs，但对细胞的活力及分化能力影响较大，对骨髓要求量大、实验条件也较苛刻。由于BMSCs在骨髓中的含量低，细胞占比也很小，要使分离后的BMSCs有较好的活性和较高的增殖能力，采用传统的分离方法，BMSCs中通常会混杂其他细胞，导致BMSCs分离纯度不高，对其后续分化能力也有影响。
[0003]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：传统的骨髓间充质干细胞分离方法中，BMSCs中通常会混杂其他细胞，分离效果不理想。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法。
[0005]本专利技术是这样实现的，一种猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，所述猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法包括：
[0006]向收集的骨髓液中加入一定量的红细胞裂解液促使红细胞裂解，采用半换液的方法，利用BMSCs在低血清培养基中对塑料培养皿有较强的粘附性的特点，在换液的过程中逐渐除去不贴壁的杂细胞，并通过传代纯化细胞。
[0007]进一步，所述猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法包括以下步骤：
[0008]步骤一，利用PBS冲洗腿骨外部，并利用全骨髓干细胞培养液采集骨髓；
[0009]步骤二，将冲洗后的全骨髓干细胞培养液移至离心管中进行离心；
[0010]步骤三，加红细胞裂解液，吹打，静置；
[0011]步骤四，将经步骤三静置后的液体进行离心，收集细胞层；
[0012]步骤五，向细胞沉淀中加入培养液，每三天更换一半培养基；
[0013]步骤六，第9天对细胞进行传代。
[0014]进一步，所述步骤一中的采集骨髓包括：
[0015]获取小猪的大腿骨，并用含3％、1％青链霉素的PBS多次冲洗腿骨外部，在无菌超
净台中，用经高压灭菌过的手术刀将猪腿骨两端脆骨削开露出红色骨髓，用20mL无菌注射器头戳穿骨髓两端。
[0016]进一步，所述步骤一中的采集骨髓还包括：
[0017]用10mL含1％青链霉素的PBS清洗将穿孔的猪腿骨的外部轻轻清洗干净，将穿孔的猪腿骨放于新的10cm培养皿中。
[0018]进一步，所述步骤一中的采集骨髓还包括：
[0019]用1mL的一次性无菌注射器抽取5mL全骨髓干细胞培养液，从腿骨一端向另一端冲洗骨髓内部，反复冲洗骨髓3～5次。
[0020]进一步，所述步骤二中的离心包括：
[0021]将冲洗后的全骨髓干细胞培养液移至15mL离心管中，1200r/min离心5min，弃上清液，得细胞沉淀。
[0022]进一步，所述步骤三中的加红细胞裂解液包括：
[0023]加入步骤二所述细胞沉淀5倍体积量的红细胞裂解液，轻轻吹打细胞沉淀，静置5min。
[0024]进一步，所述步骤四中的离心包括：
[0025]静置后的液体在1200r/min的转速下离心5min，弃上清，得细胞沉淀。
[0026]进一步，所述步骤五中，向步骤四所述细胞沉淀中加10mL干细胞培养液，并将吹打后的细胞悬液铺于T75细胞培养瓶，每隔3d对细胞进行一次半换液。
[0027]进一步，所述步骤六中，在第9天BMSCs的细胞形态明显区别于其他类型的细胞时进行传代，所述细胞传代包括：
[0028]吸出全部培养液，加入预热的PBS轻柔清洗一次，弃去PBS，加2mL胰酶消化1～3min；将培养瓶置于显微镜下观察，待细胞变圆漂浮时加入6～9mL含血清的培养基或1mL血清终止消化；用巴氏吸管吹打使细胞从培养瓶壁上脱落下来，收集液体至15mL离心管，1200r/min离心5min，弃上清；向细胞沉淀中加10mL干细胞培养液，细胞悬液铺于10cm细胞培养皿中。
[0029]结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本专利技术所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
[0030]第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本专利技术的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本专利技术技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
[0031]从猪腿骨的骨髓中分离出纯度较高的间充质干细胞，并保证细胞较好的活性，能增殖。由于骨髓中间充质干细胞占比较少，同时骨髓中含有大量红细胞和其他类型的杂细胞，采用传统分离方法获得的BMSCs纯度不高，通常还需借助流式细胞仪来分选细胞，需要一定的技术要求且成本高。故通过本专利技术提供的优化实验步骤，简洁高效的分离出纯度较高的BMSCs，并使之大量增殖，可满足后续的其他研究；一是加入用红细胞裂解液来裂解骨髓液中的红细胞这一步骤，可以快速去除大量红细胞，提高分离BMSCs的纯度；二是在细胞铺板后每三天进行一次半换液，而不是一次性换走全部培养液，这样可以在注入新鲜培养液的同时又尽可能多的保留BMSCs；三是在铺板后的第9天，BMSCs的细胞形态显现后进行传代，可进一步去除杂细胞，纯化BMSCs。
[0032]腿骨中的骨髓液含有大量红细胞，影响BMSCs的分离，本专利技术通过向收集的骨髓液中加入一定量的红细胞裂解液来促使红细胞裂解，进而提高BMSCs的分离效率；再利用BMSCs在低血清培养基中对塑料培养皿有较强的粘附性的特点，在换液的过程中逐渐除去不贴壁的杂细胞，从而达到分离纯化BMSCs的目的，其操作简单且不易污染。采用本专利技术提供的半换液方法，在一定程度上可以保留更多的BMSCs，以免只更换一次培养液损失许多还未贴壁的细胞。
[0033]本专利技术提供的猪骨髓间充质干细胞分离培养优化方法还具有以下优点：
[0034]①
用含青链霉素的PBS多次冲洗外部，保证了无菌，消除外部污染对后续细胞培养的影响。用全骨髓干细胞培养液冲洗骨髓，使我们要分离的BMSCs一开始就处于适宜生长的培养液中；
[0035]②
第一次离心后获得鲜红色的细胞沉淀(此时细胞沉淀中含有大量红细胞)，弃上清，去除本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，其特征在于，所述猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法包括：向收集的骨髓液中加入一定量的红细胞裂解液促使红细胞裂解，采用半换液的方法，利用BMSCs在低血清培养基中对塑料培养皿有较强的粘附性的特点，在换液的过程中逐渐除去不贴壁的杂细胞，并通过传代纯化细胞。2.如权利要求1所述的猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，其特征在于，所述猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法包括以下步骤：步骤一，利用PBS冲洗腿骨外部，并利用全骨髓干细胞培养液采集骨髓；步骤二，将冲洗后的全骨髓干细胞培养液移至离心管中进行离心；步骤三，加红细胞裂解液，吹打，静置；步骤四，将经步骤三静置后的液体进行离心，收集细胞层；步骤五，向细胞沉淀中加入培养液，每三天更换一半培养基；步骤六，第9天对细胞进行传代。3.如权利要求2所述的猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，其特征在于，所述步骤一中的采集骨髓包括：获取小猪的大腿骨，并用含3％、1％青链霉素的PBS多次冲洗腿骨外部，在无菌超净台中，用经高压灭菌后的手术刀将猪腿骨两端脆骨削开露出红色骨髓，用20mL无菌注射器头戳穿骨髓两端。4.如权利要求2所述的猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，其特征在于，所述步骤一中的采集骨髓还包括：用10mL含1％青链霉素的PBS清洗将穿孔的猪腿骨的外部轻轻清洗干净，将穿孔的猪腿骨放于新的10cm培养皿中。5.如权利要求2所述的猪骨髓间充质干细胞分离培养的优化方法，其特征在于，所述步骤一中的采集骨髓还包括：用1mL的一次性无菌注射器抽取5mL全骨髓干细胞培养液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宁，金龙，张宇，贺力，李明洲，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：