一种多能干细胞来源肾脏间充质干细胞的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种多能干细胞来源肾脏间充质干细胞的制备方法及其应用，该制备方法是将多能干细胞解离，经历三个阶段诱导为中间中胚细胞后，在间充质干细胞培养液中连续传代培养获得。本发明专利技术不但解决了其他非限定诱导方法诱导的各中胚层细胞混杂及间充质干细胞的异质性问题，而且明确了肾脏间充质干细胞在肾脏损伤修复中的优势作用，为研究肾脏发育提供完美的体外模型，为临床肾脏损伤治疗提供新的、高潜力的细胞来源。同时本发明专利技术提供了一种用于肾脏间充质干细胞的充质干细胞无血清完全培养液，解决了动物源性及人源性干细胞培养液易引起的免疫排斥问题，能高效稳定获得批次间稳定、均质性高的间充质干细胞细胞群体。均质性高的间充质干细胞细胞群体。均质性高的间充质干细胞细胞群体。

【技术实现步骤摘要】
一种多能干细胞来源肾脏间充质干细胞的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及干细胞
，具体地，涉及一种多能干细胞来源肾脏间充质干细胞的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]成体干细胞是一类存在于生物体内，具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体，成体干细胞在机体的新陈代谢及损伤修复中起着不可或缺的作用。其中的间充质干细胞 (Mesenchymal stem cell，MSC)更是干细胞研究与再生医学领域的“主角”。MSC的研究始于1968年，当时Freidenstein提出骨髓中存在一群形态和成纤维细胞相似且呈克隆性增殖的贴壁细胞，随后经证实其具有自我更新和多向分化潜能。目前研究支持人体多种组织甚至实体器官中均能分离获得MSC。由于MSC具有自我复制、多向分化和免疫调节、旁分泌和造血支持等出众的优点，在组织工程、临床研究中被广泛应用，据ClinicalTrials.gov 网站介绍，自2006年以来，MSC相关临床试验的数量不断增加，迄今已注册的MSC临床试验有1400多项。这些临床试验多集中于关节炎、慢性移植物抗宿主病、心脏病、阿兹海默症等疾病，使用包括骨髓、脂肪、脐带等不同组织来源甚至不同个体来源的MSC。然而MSC临床试验的结果显示其治疗效果个体化差异较大，缺乏可重复性、甚至有效性。除了MSC治疗机制不明确、批次间细胞质量难控制之外，更深层次的原因可能是不同组织来源MSC中存在不同发育起源/不同功能的异质性细胞群，因此不同发育起源的MSC 可能在细胞治疗应用中具有不尽相同的优势作用。
[0003]已知MSC的发育起源包括神经嵴(形成牙髓、牙龈及骨髓MSC等)、中胚层(形成骨髓和脏器MSC等)和滋养层(形成脐带和胎盘MSC等)。中胚层作为间充质干细胞的主要来源之一，本身在体内发育的过程中，可以细分成轴旁中胚层(Paraxial MesodermPM)、侧板中胚层(Lateral Mesoderm LM)、中间中胚层(Intermediate Mesoderm IM)。其中中间中胚层(IM)位于轴旁中胚层与侧板中胚层之间的狭长区域，是形成泌尿与生殖系统的主要器官原基，在体内能进一步发育成肾脏以及性腺。
[0004]近年来，绝大部分研究致力于在体外将多能干细胞经历中间中胚层阶段后诱导为成熟肾脏细胞，而这种成熟的肾脏细胞不但诱导周期长，诱导效率低、存在免疫原性而且在体外扩增代数受限，很难进一步应用于临床治疗中。(例如：Journal of the American Society of Nephrology,2014,25(6):1211
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1225；Nature Communications,2014,4:1367；Kidney Development,Disease,Repair and Regeneration,2016:473
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490.)
[0005]另外，已有文献报道(Biomaterials.2015May；50:56
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66.)称小鼠肾脏中分离得到的 Nestin+MSC亚群，具备很强的旁分泌、免疫调节和肾脏组织原位损伤修复能力，提示与肾脏来源MSC具有相同发育起源的中间中胚层来源MSC可能促进肾脏的损伤修复。但是由于人成体内分离肾脏MSC有极大的创伤性且伦理受限，也难以进一步应用于临床。
[0006]目前，并未见有任何报道将多能干细胞诱导为特异性中间中胚层细胞(排除混杂细胞，包括其他中胚层细胞，甚至是其他胚层细胞)，同时进一步将特异性中间中胚层细胞
诱导为低免疫原性、可在体外大量扩增肾脏间充质干细胞。因此，研究如何在体外由多能干细胞诱导并获得能发育成肾脏的中间中胚层细胞，以及中间中胚层来源肾脏间充质干细胞对肾脏相关疾病治疗有着非常重大的研究意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是为了克服现有技术的中非限定诱导方法诱导的各中胚层细胞混杂及间充质干细胞异质性问题，提供一种多能干细胞来源肾脏间充质干细胞的制备方法及其应用。本专利技术方案可以高效诱导得到特异性的中间中胚层细胞(IMs)，解决了非限定诱导方法诱导的各中胚层细胞(包括PMs和LMs)混杂问题，还提供了一种均质的、能够有效治疗肾脏损伤的肾脏间充质干细胞。同时本专利技术研制的一种用于肾脏间充质干细胞的间充质干细胞无血清完全培养液(MMⅠ)，排除现有培养液动物源性成分及人源性培养液扩增培养带来的免疫排斥问题。两者共同解决了肾脏细胞来源受限、扩增受限、纯度受限的问题，最终获得的肾脏间充质干细胞将会是临床治疗肾脏损伤相关疾病中新的、高质量的细胞来源。
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种特异性诱导中间中胚层细胞的培养液组合物。
[0009]本专利技术的第二个目的是提供一种特异性诱导中间中胚层细胞的制备方法。
[0010]本专利技术的第三个目的是提供所述制备方法诱导得到的中间中胚层细胞。
[0011]本专利技术的第四个目的是提供一种间充质干细胞无血清完全培养液。
[0012]本专利技术的第五个目的是提供一种多能干细胞来源肾脏间充质干细胞的制备方法。
[0013]本专利技术的第六个目的是提供所述的制备方法诱导得到的肾脏间充质干细胞。
[0014]本专利技术的第七个目的是提供所述的中间中胚层细胞和/或所述的肾脏间充质干细胞，在制备抑制炎症因子TNFα表达和/或促进IDO
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1表达的免疫调节药物，或细胞治疗肾脏损伤的制剂中的应用。
[0015]本专利技术的第八个目的是提供所述的组合物在诱导中间中胚层细胞和/或肾脏间充质干细胞中的应用。
[0016]本专利技术的第九个目的是提供所述的间充质干细胞无血清完全培养液在诱导肾脏间充质干细胞中的应用。
[0017]本专利技术制定标准化的诱导分化流程，将多能干细胞(Pluripotent Stem Cell，PSC)先后经历三个不同阶段的限定诱导培养液特异性诱导为中间中胚层细胞(hiPSC
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IMs)，并经中间中胚层细胞(IMs)阶段在间充质干细胞培养液中进一步诱导为间充质干细胞 (Mesenchymal Stem Cell，MSCs)，最终获得多能干细胞来源肾脏间充质干细胞。
[0018]本专利技术为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
[0019]本专利技术中所使用的“IMs”是指中间中胚层细胞。
[0020]本专利技术中所使用的“PMs”是指轴旁中胚层细胞。
[0021]本专利技术中所使用的“LMs”是指侧板中胚层细胞。
[0022]本专利技术中所使用的“hiPSC
‑
IMs”是指由人诱导多能干细胞特异性诱导的中间中胚层细胞。
[0023]本专利技术中所使用的“H1
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IMs”是指由胚胎干细胞特异性诱导的中间中胚层细胞。
[0024]本专利技术中所使用的“IM
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MSCs”是指由多能干细胞特异性诱导的中间中胚层来源肾脏间充质干细胞。
[0025]因此本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性诱导中间中胚层细胞的培养液的组合物，其特征在于，包括StageⅠ培养液、StageⅡ培养液、和StageⅢ培养液，其中，StageⅠ培养液为含有ROCK信号通路抑制剂的mTeSR培养液或含有ROCK信号通路抑制剂的Essential 8
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培养液；StageⅡ培养液为含有的ITS培养补充剂、NEAA细胞培养添加物、GSK3抑制剂、TGFβ信号通路激动剂和FGF信号通路激动剂的基础培养液；StageⅢ培养液为含有的ITS培养补充剂、NEAA细胞培养添加物、视黄酸(Retinoic acid,RA)、BMP信号通路抑制剂、FGF信号通路激动剂和TGFβ信号通路激动剂的基础培养液。2.一种特异性诱导中间中胚层细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.未分化状态的多能干细胞体外贴壁培养至80～90％密度后，用细胞消化液消化成单个细胞或多细胞团块；S2.用权利要求1中所述的StageⅠ培养液重悬上一步的产物，接种到包被基质胶的培养容器中进行贴壁培养；S3.贴壁培养1～4天后更换为权利要求1中所述的StageⅡ培养液继续培养1～10天；S4.更换为权利要求1中所述的StageⅢ培养液，继续培养2～10天，即得特异性中间中胚层细胞。3.权利要求2所述制备方法诱导得到的中间中胚层细胞。4.一种间充质干细胞无血清完全培养液，其特征在于，为含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：项鹏，李伟强，韦伊利，柯琼，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：