自体母乳干细胞的体外培养方法、注射剂及其在皮肤损伤修复中的应用技术

本申请公开了自体母乳干细胞的体外培养方法、注射剂及其在皮肤损伤修复中的应用。该体外培养方法包括：分离母乳干细胞；诱导分化母乳干细胞，使得母乳干细胞分化为成纤维细胞，诱导分化采用机械张力条件下，将所母乳干细胞置于张力培养基中进行培养；负载培养成纤维细胞，以得到复合体，复合体为聚乳酸水凝胶与成纤维细胞的复合物。该成纤维细胞高效表达细胞波形蛋白、纤维连接蛋白以及高表达I/III型胶原蛋白。该复合体能够通过PI3K/Akt信号通路机制，促使疤痕皮肤I/III型胶原蛋白高效表达，I/III型胶原蛋纤维排列正常化，具有促进疤痕修复的功能，具有广泛应用于创面修复、皮肤皱纹、疤痕祛除、抗衰老等应用前景。抗衰老等应用前景。抗衰老等应用前景。

【技术实现步骤摘要】
自体母乳干细胞的体外培养方法、注射剂及其在皮肤损伤修复中的应用


[0001]本申请涉及皮肤损伤修复
，尤其涉及自体母乳干细胞的体外培养方法、注射剂及其在皮肤损伤修复中的应用。

技术介绍

[0002]干细胞在皮肤损伤修复以及组织再生方面具有巨大潜力，其不仅可以再生丧失的组织，亦可通过旁分泌方式促进伤口修复和愈合。目前，胚胎干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞、组织干细胞、上皮干细胞、脂肪干细胞和造血干细胞等均成为皮肤损伤修复以及组织再生方面研究热点。
[0003]其中，移植干细胞也为伤口愈合的研究提供了巨大的进展，但具体作用机制尚不清楚，仍需进一步探究来探索和验证其对伤口的愈合机制，以及大量的临床应用研究进行深入的探索研究，以确定理想的干细胞来源和最有效的细胞传递方式，促进伤口愈合，为创伤患者带来福音，也为其能够应用于皮肤皱纹、疤痕祛除、抗衰老等领域提供帮助。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本申请的目的在于通过体外培养获得一种易于注射的细胞复合体，以产生具有皮肤损伤修复的功能。
[0005]第一方面，本申请实施例公开了一种自体母乳干细胞的体外培养方法，包括以下步骤：
[0006]分离来母乳干细胞；
[0007]诱导分化所述母乳干细胞，使得所述母乳干细胞分化为成纤维细胞，所述诱导分化采用机械张力条件下，将所述母乳干细胞置于张力培养基中进行培养；其中，所述机械张力条件为：拉伸最大幅度5～8％，加力频率0.1～0.15Hz，加力波形为正弦波；
[0008]负载培养成纤维细胞，以得到复合体，所述复合体为聚乳酸水凝胶与所述成纤维细胞的复合物。
[0009]在本申请实施例中，所述张力培养基以DMEM/F
‑
12为基础，向其中添加糖皮质激素和植物甾醇类物质，使得糖皮质激素的浓度为 0.5～1.5mmol/L，植物甾醇的浓度为0.01～0.03mmol/L。
[0010]在本申请实施例中，所述植物甾醇选自β
‑
谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇中的至少一种。
[0011]在本申请实施例中，所述聚乳酸水凝胶的制备方法包括：
[0012]将丝素粉加至沸水中，并同时加入碳酸钠，搅拌充分煮沸30min后；
[0013]过滤取出丝素粉、纳米聚乳酸粉末充分混合后加入至10mol/L LiBr 溶液中，充分混合后，置于60℃烘箱中6h；
[0014]将溶液装入透析袋中透析3天得以去除Liar；
[0015]将透析后的溶液离心多次，去除杂质后置于冷冻干燥机中干燥，即可获得所述聚乳酸水凝胶。
[0016]在本申请实施例中，加入至10mol/L LiBr溶液中丝素浓度为 1.0～1.5g/L，纳米聚乳酸浓度为0.15～0.3g/L。
[0017]在本申请实施例中，所述负载培养步骤包括：
[0018]将所述聚乳酸水凝胶进行超声处理后，加入至负载培养基中，水凝胶占所述负载培养基的比例为50～60wt％，并接种所述成纤维细胞，负载培养周期为8～15天。
[0019]在本申请实施例中，所述负载培养基以DMEM/F
‑
12为基础，向其中添加成纤维细胞生长因子、维生素C磷酸酯、脯氨酸和赖氨酸，并使得成纤维细胞生长因子浓度为1～10mmol/L，维生素C磷酸酯浓度为 0.01～0.05mmol/L，脯氨酸浓度为0.1～0.5mmol/L，赖氨酸浓度为 0.1～0.5mmol/L。
[0020]在本申请实施例中，经诱导分化后得到的细胞中含成纤维细胞的数量不低于80％。
[0021]第二方面，本申请实施例公开了一种注射剂，包含第一方面所述的体外培养方法值得的复合体。
[0022]第三方面，本申请实施例公开了第一方面所述的体外培养方法值得的复合体、或第二方面所述的注射剂在皮肤损伤修复中的应用。
[0023]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
[0024]本申请实施例通过将自体母乳干细胞的体外培养得到了一种负载有成纤维细胞的复合体，该成纤维细胞高效表达细胞波形蛋白、纤维连接蛋白以及高表达I/III型胶原蛋白。并通过动物实验将该复合体注射至大白鼠疤痕处，能够通过PI3K/Akt信号通路机制，促使大白鼠疤痕处I/III型胶原蛋白高效表达，促使疤痕处真皮组织中I/III型胶原蛋纤维排列正常化，具有促进疤痕修复的功能，具有广泛应用于创面修复、皮肤皱纹、疤痕祛除、抗衰老等应用前景。
附图说明
[0025]图1为本申请实施例1提供的机械张力培养后的细胞镜检图。
[0026]图2为本申请对比例1提供的机械张力培养后的细胞镜检图。
[0027]图3为本申请对比例2提供的机械张力培养后的细胞镜检图。
[0028]图4为本申请对比例3提供的机械张力培养后的细胞镜检图。
[0029]图5为大白鼠疤痕处给予本申请实施例1提供的复合体后的皮肤组织石蜡切片HE染色图。
[0030]图6为大白鼠疤痕处给予本申请对比例4提供的复合体后的皮肤组织石蜡切片HE染色图。
[0031]图7为大白鼠疤痕处给予本申请对比例5提供的复合体后的皮肤组织石蜡切片HE染色图。
[0032]图8为大白鼠疤痕处给予本申请对比例6提供的复合体后的皮肤组织石蜡切片HE染色图。
具体实施方式
[0033]为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
[0034]自体母乳干细胞(BSCs)的体外培养
[0035]本申请实施例采用自体母乳干细胞进行体外培养，获得一种体外培养的注射剂，该注射剂包含负载有母乳干细胞的复合体，该复合体具有修复大白鼠疤痕皮肤的作用。其具体的制备过程包括BSCs的分离、细胞机械张力培养处理和制备复合体的过程，具体过程如下：
[0036]1、材料与方法
[0037]1.1、BSCs的分离
[0038]取成熟的大白雌性鼠(大白鼠，体长为16～21cm，体重约300克左右，购自西安交大医学院实验动物中心)母乳(180mL)，于无菌环境中用等体积的PBS(pH7.4)稀释母乳，于1500g条件下离心20min，去除上层的脱脂牛奶液成分和脂肪层，下层的细胞颗粒继续加入同等体积的上述 PBS，1500g离心20min，清洗细胞颗粒，去除上清液，如此重复3次。
[0039]再次加入含有10％胎牛血清(默克Sigma
‑
Aldrich)的PBS对细胞颗粒进行重悬。为了确定每个样品的细胞活力和细胞浓度，使用诺鲍尔血细胞计数仪进行检测。
[0040]将上述分离的具有较高活力的BSCs的(104个/mL)接种至含有25mLDMEM培养基的T25培养瓶中，接种量为2.5mL，在5％CO2和37℃下培养，并每天更换培养基，培养基为DMEM培养基(赛默飞)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种自体母乳干细胞的体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：分离来母乳干细胞；诱导分化所述母乳干细胞，使得所述母乳干细胞分化为成纤维细胞，所述诱导分化采用机械张力条件下，将所述母乳干细胞置于张力培养基中进行培养；其中，所述机械张力条件为：拉伸最大幅度5～8％，加力频率0.1～0.15Hz，加力波形为正弦波；负载培养成纤维细胞，以得到复合体，所述复合体为聚乳酸水凝胶与所述成纤维细胞的复合物。2.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述张力培养基以DMEM/F
‑
12为基础，向其中添加糖皮质激素和植物甾醇类物质，使得糖皮质激素的浓度为0.5～1.5mmol/L，植物甾醇的浓度为0.01～0.03mmol/L。3.根据权利要求2所述的体外培养方法，其特征在于，所述植物甾醇选自β
‑
谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇中的至少一种。4.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述聚乳酸水凝胶的制备方法包括：将丝素粉加至沸水中，并同时加入碳酸钠，搅拌充分煮沸30min后；过滤取出丝素粉、纳米聚乳酸粉末充分混合后加入至10mol/L LiBr溶液中，充分混合后，置于60℃烘箱中6h；将溶液装入透析袋中透析3天得以去除Liar；将透析后的溶液离心多次，去除杂质后置于冷冻干燥...

【专利技术属性】
技术研发人员：王智亮，温泉，
申请(专利权)人：江西龙卿堂科技有限公司，
类型：发明
国别省市：