蛋白质降解的调节制造技术

提供了评估剂在治疗疾病或病症方面的功效的方法，所述方法包括确定所述剂是否引起或抑制精氨酸琥珀酸合成酶1(ASS1)的直接或间接募集和/或泛素化和/或降解。募集和/或泛素化和/或降解。募集和/或泛素化和/或降解。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】蛋白质降解的调节


[0001]基于塞勒布隆(CRBN)与精氨酸琥珀酸合成酶1(ASS1)的相互作用的存在、不存在或水平提供了筛选化合物和/或评估化合物在治疗疾病或病症方面的功效的方法。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求2019年12月17日提交的美国临时申请号62/949,021的权益，该临时申请的全部内容并入本文。

技术介绍

[0004]通过将靶蛋白导引到蛋白酶体来消除细胞中的靶蛋白的靶蛋白质降解，或通过将靶蛋白捕获在高级蛋白质复合物中的靶蛋白抑制，是药物发现中引人注目的新领域。分子胶和蛋白质降解的二价诱导物(也称为蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC))代表引人注目的治疗新方式，因为它们有可能以使用常规抑制剂无法实现的方式抑制和/或降解(包括以亚化学计量浓度抑制和/或降解)此前被认为不可被用药(undruggable)的靶点。分子胶和PROTAC结合至细胞内的某些蛋白质，从而诱导抑制或降解疾病靶蛋白的分子复合物的形成。
[0005]虽然这些剂的潜力很大，但是它受到某些倾向性(liabilities)的阻碍，诸如，这些剂接合非治疗相关靶点的靶点(偏离靶点)，并且它们的接合会带来药物副作用和毒性的风险并且/或者减少治疗相关靶点的有效接合(例如，由于任何偏离靶点的竞争性接合)。仍然需要发现没有此类倾向性的剂。

技术实现思路

[0006]因此，在各个方面，本专利技术提供了对促进、诱导、增强和/或稳定小分子
‑
蛋白质(或小分子
‑
蛋白质复合物)相互作用并且/或者缺乏或具有显著减少的靶点倾向性的治疗剂的发现。本专利技术在各种实施方案中提供了，用于鉴定这样的化合物的方法，所述化合物由于对疾病相关靶点的更具选择性的调节而对疾病治疗更有效和/或具耐受性，不会与无关的或构成风险的或有害的(例如偏离靶点的)相互作用发生交叉反应以及向所述相互作用偏离。
[0007]在一些方面，本专利技术涉及鉴定这样的化合物的方法，所述化合物不受与精氨酸琥珀酸合成酶1(ASS1)的直接或间接相互作用的影响以及/或者不诱导与精氨酸琥珀酸合成酶1的直接或间接相互作用。例如，在实施方案中，本专利技术提供了对这样的化合物的选择，所述化合物具有减少的、低的或基本上没有引起、诱导、增强或稳定ASS1向蛋白质复合中物的募集以及/或者因此抑制ASS1和/或促进ASS1的泛素化和/或降解的活性或能力。在实施方案中，本专利技术提供了对这样的化合物的选择，所述化合物具有减少的、低的或基本上没有引起、诱导、增强或稳定ASS1与CRBN的直接结合的活性或能力。
[0008]在各个方面，本专利技术涉及一种鉴定候选化合物的方法，所述方法通过以下步骤来进行：获得具有结合至塞勒布隆(CRBN)的能力的测试化合物，在存在ASS1的情况下使所述测试化合物与CRBN接触，测定以下中的一者或多者：ASS1向CRBN的募集、ASS1与所述CRBN/
protein
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protein interactions,”Methods Mol Biol.2015；1278:447
‑
55和Lievens等人“Array MAPPIT:high
‑
throughput interactome analysis in mammalian cells,”J Proteome Res.2009年2月；8(2):877
‑
86，这些文献的全部内容以引用的方式并入本文)描述并且在实施例1中更详细地概述的双杂交技术系统MAPPIT的变型在人ORF(eome)cDNA文库中筛选响应于CC220(一种已知的IMiD药物和CRBN配体)而募集到CRBN的靶点来鉴定。在以阵列形式显示的细胞簇内测定细胞中的蛋白质相互作用。细胞微阵列中的每个点均对应于此种表达单个ORF/蛋白质候选物的细胞簇，其正在经受配体诱导的(在这种情况下是CC220诱导的)与CRBN的相互作用测试。正相互作用被读出为细胞荧光的增加。示出了在大量单个ORF/靶蛋白候选物中/针对单个ORF/靶蛋白候选物进行细胞微阵列筛选获得的荧光强度数据的点图。X轴示出粒子计数，Y轴示出微阵列中的每个细胞簇的积分强度。如图所示和指示，对于表示ASS1 ORF的细胞阵列坐标，观察到显著的信号诱导。还示出了IKZF1(一种已知的CC220诱导的CRBN相互作用物)的信号诱导以供参考。
[0018]图2作为分子胶诱导的CRBN新底物的内源性ASS1的鉴定。内源性ASS1被使用“蛋白质陷阱”技术鉴定为来那度胺诱导的CRBN相互作用物，该“蛋白质陷阱”技术称为ViroTrap，并且在先前有描述(Eyckerman等人“Trapping mammalian protein complexes in viral particles,”Nature Communications 7:11416(2016)，该文献的全部内容以引用的方式并入本文)，并且在实施例2中更详细的概述。通过鉴定来自病毒样颗粒的ASS1胰蛋白酶肽来检测响应于来那度胺的ASS1与CRBN的结合，所述病毒样颗粒含有在颗粒出芽过程中募集到此种颗粒中的细胞CRBN(包括任何相关的一种或多种蛋白质)。因此，示出了从含有病毒样颗粒的CRBN分离的肽的胰蛋白酶肽同一性的火山图，所述病毒样颗粒使用ViroTrap程序从暴露于来那度胺(LEN)与DMSO对照媒介物的细胞分离(以鉴定LEN诱导的CRBN相互作用物)。对应于ASS1的胰蛋白酶肽信号(log10 p值)以及在存在来那度胺(LEN)或DMSO对照媒介物(X轴)的情况下ASS1胰蛋白酶肽信号的相对倍数变化将内源性ASS1鉴定为LEN诱导的CRBN相互作用物。
[0019]图3A
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B活细胞中的配体诱导的CRBN
‑
ASS1相互作用
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如通过免疫共沉淀分析所评估。在这项研究中，我们检查了在存在或不存在CRBN IMiD配体CC220的情况下，Flag标记的ASS1(或Flag标记的gp130
‑
ASS1融合蛋白，如在图1中描述的测定法中所鉴定)和HA标记的CRBN在HEK293T细胞中转染和表达每个构建体后在活细胞中相互作用的能力。还检查了HA标记的CRBN响应于CC220与已知的CRBN新底物IKZF3相互作用的能力(IKZF3表达为Flag标记的IKZF3融合蛋白)。图3A示出了与抗Flag抗体进行免疫共沉淀，随后对免疫沉淀样品进行蛋白质印迹分析，并且使用Flag肽从珠粒洗脱所获得的结果。用抗HA抗体进行蛋白质分析以确定每个样品中的免疫沉淀CRBN的程度(预计会随着CC220暴露而变化)，并且用抗Flag抗体进行蛋白质分析以确定每个样品中的免疫沉淀Flag
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ASS1、Flag
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gp130
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ASS1或Flag
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IKZF3的程度(预计相同)。如图3A(上图)所示，HA
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于鉴定候选化合物的方法，其包括：(a)获得具有结合至塞勒布隆(CRBN)的能力的测试化合物；(b)在存在精氨酸琥珀酸合成酶1(ASS1)的情况下使所述测试化合物与CRBN接触；(c)测定ASS1的直接或间接募集和/或泛素化和/或降解；以及(d)如果检测到减少的、低的或基本上没有ASS1的直接或间接募集和/或泛素化和/或降解，则将所述测试化合物分类为候选化合物。2.一种用于制备治疗组合物的方法，其包括：(a)鉴定候选化合物，所述鉴定通过以下步骤进行：(i)获得具有结合至塞勒布隆(CRBN)的能力的测试化合物；(ii)在存在精氨酸琥珀酸合成酶1(ASS1)的情况下使所述测试化合物与CRBN接触；(iii)测定ASS1的直接或间接募集和/或泛素化和/或降解；以及(iv)如果检测到减少的、低的或基本上没有ASS1的直接或间接募集和/或泛素化和/或降解，则将所述测试化合物分类为候选化合物；以及(b)将所述候选化合物配制用于疗法。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述ASS1的募集是ASS1与CRBN的直接结合。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，所述方法进一步包括测定非ASS1的CRBN的底物和/或新底物的直接或间接募集和/或泛素化和/或降解，所述非ASS1的CRBN的底物和/或新底物任选地包含：(i)降解决定子基序，(ii)表面β
‑
发夹环，其任选地具有位于转角顶点处的三个主链氢键受体的布置，随后是甘氨酸残基，和/或(iii)保守的Cys2‑
His2(C2H2)基序。5.如权利要求4所述的方法，其中所述非ASS1的CRBN的底物和/或新底物选自Ikaros(IKZF1)、Helios(IKZF2)、Aiolos(IKZF3)、Eos(IKZF4)、Pegasus(IKZF5)、CSNK1A、CK1a和ZFP91。6.如权利要求4或5所述的方法，其中所述减少的、低的或基本上没有ASS1的直接或间接募集和/或泛素化和/或降解是相对于非ASS1的CRBN的底物和/或新底物的直接或间接募集和/或泛素化和/或降解的量而言。7.如权利要求4
‑
6中任一项所述的方法，其中所述分类是基于所述测试化合物更改ASS1的直接或间接募集和/或泛素化和/或降解相对于非ASS1的CRBN的底物和/或新底物的直接或间接募集和/或泛素化和/或降解的比率的能力。8.如权利要求7所述的方法，其中所述分类是基于所述测试化合物更改ASS1的直接或间接募集和/或泛素化和/或降解与非ASS1的CRBN的底物和/或新底物的直接或间接募集和/或降解的比率，以利于非ASS1的CRBN的底物和/或新底物的直接或间接募集和/或泛素化和/或降解的能力。9.如权利要求4
‑
8中任一项所述的方法，其中基于与ASS1的直接或间接募集和/或泛素化和/或降解相比利于非ASS1的CRBN的底物和/或新底物的直接或间接募集和/或泛素化和/或降解的能力，将所述测试化合物分类为候选化合物。10.如权利要求1
‑
9中任一项所述的方法，其中所述减少的、低的或基本上没有ASS1的
直接或间接募集和/或泛素化和/或降解是相对于缺乏所述测试化合物的参考样品中ASS1的直接或间接募集和/或泛素化和/或降解的量和/或基础水平而言。11.如权利要求1
‑
10中任一项所述的方法，其中相对于沙利度胺、来那度胺和泊马度胺中的一者而言，所述候选化合物在接受所述候选化合物的受试者中表现出减少的副作用。12.如权利要求11所述的方法，其中所述副作用包括肝功能降低或受损以及/或者包括肾功能降低或受损和/或T细胞功能降低或受损。13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试化合物或候选化合物结合CRBN但弱结合至或基本上不结合ASS1。14.如权利要求4
‑
12中任一项所述的方法，其中所述测试化合物或候选化合物结合CRBN但弱结合至或基本上不结合非ASS1的CRBN的底物和/或新底物。15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试化合物或候选化合物以约1μM或更高的亲和力结合CRBN。16.如权利要求15所述的方法，其中所述测试化合物或候选化合物以约500nM，或约300nM、约100nM、约30nM、约10nM或约1nM的亲和力结合CRBN。17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试化合物或候选化合物是分子胶。18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试化合物或候选化合物包含戊二酰亚胺环和邻苯二甲酰亚胺环。19.如权利要求18所述的方法，其中所述邻苯二甲酰亚胺环是经化学改性的。20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述测试化合物或候选化合物的所述戊二酰亚胺环能够与CRBN中的三个色氨酸残基笼氢键结合。21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试化合物或候选化合物诱导CRBN的疏水性表面的暴露，从而允许与非ASS1的CRBN的底物和/或新底物的相互作用。22.如权利要求21所述的方法，其中CRBN的疏水性表面的暴露允许与非ASS1的CRBN的底物和/或新底物的相互作用。23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试化合物或候选化合物是免疫调节药物或免疫调节酰亚胺药物(IMiD)或者它们的药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物。24.如权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：N，
申请(专利权)人：奥里尼斯生物科学私人有限公司，
类型：发明
国别省市：