表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的枯草芽孢杆菌及应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及一种表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的枯草芽孢杆菌及应用。本发明专利技术将表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的重组质粒转化至枯草芽孢杆菌WB800N，获得了一种表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的重组枯草芽孢杆菌；所述重组枯草芽孢杆菌在高效表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的同时，具有良好的免疫反应性，能够诱导机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答。还可以作为黏膜疫苗，经口服免疫后，产生较高水平的抗原特异性IgG抗体及黏膜sIgA抗体，升高外周血CD4

【技术实现步骤摘要】
表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的枯草芽孢杆菌及应用


[0001]本专利技术涉及生物制药领域，具体涉及一种表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的枯草芽孢杆菌及应用。
技术背景
[0002]口蹄疫(Foot
‑
and
‑
mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot
‑
and
‑
mouth disease viru s，FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，主要感染猪、牛、羊等偶蹄类动物，给畜牧养殖业造成巨大经济损失。FMDV共有7个血清型，即O型、A型、亚洲1型(Asia 1)、南非1型(Southern African Territories 1，SAT1)、南非2型(SAT2)、南非3型(SAT 3)和C型，我国主要流行O型和A型。南非型口蹄疫地域性较为明显，主要集中在撒哈拉沙漠以南，但近几年的报告表明，SAT2型口蹄疫已跨越非洲，在中东地区蔓延和爆发，传入东南亚和我国的风险较高，对我国养殖业造成潜在威胁。因此，急需针对SAT2型FMDV开展疫苗研发，为我国口蹄疫防控进行技术储备。
[0003]目前防控口蹄疫最经济有效的措施是免疫疫苗，口蹄疫灭活疫苗是我国口蹄疫防控的主导产品，为我国口蹄疫防控做出了巨大贡献，但自身也有一些不足，例如传统制造可能病毒灭活不完全，存在着散毒风险和安全隐患，且灭活疫苗通常无法诱导机体产生有效的黏膜免疫应答。因此，研发更加安全、高效、绿色的口蹄疫疫苗具有重要意义。
[0004]黏膜是保护机体免受病原体入侵的第一道防线，FMDV主要通过呼吸道及消化道的黏膜入侵机体，因此，诱导机体产生黏膜免疫应答对口蹄疫的预防和治疗尤为重要。而且黏膜疫苗与传统疫苗相比，有以下优点：黏膜免疫的接种方式(点眼、饮水、灌胃、舌下、滴鼻、喷雾)多样化且较为简单，无需专业技术人员就可完成免疫接种，能降低免疫过程中对动物的造成的疼痛及应激；大多数黏膜免疫方式均适用于大规模疫苗接种、且给药时无需针头和注射器，不会产生血源性疾病传播的风险。因此，口蹄疫黏膜疫苗是一种极具潜力的新型疫苗。
[0005]枯草芽孢杆菌作为一种益生菌，是较好的黏膜疫苗递送载体的候选者。虽然目前使用枯草芽孢杆菌递送抗原蛋白已有大量研究，但是并没有确切有效的口服黏膜疫苗被用于口蹄疫防控。

技术实现思路

[0006]针对上述技术问题，首先，在本专利技术研究过程中发现，以SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP0制备重组枯草芽孢杆菌WB800N/pHT43
‑
VP0时，虽然能够高效表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP0，具有良好的免疫原性，但是所诱导机体产生的体液免疫应答和细胞免疫应答水平较低，且不能诱导机体产生黏膜免疫应答，无法作为黏膜疫苗使用；而且以pMA5载体构建表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的重组质粒，虽然可成功电转化至宿主细菌B.S168，但是目的蛋白VP3不能表达；以pWB980载体构建表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的重组质粒时，VP3基因无法成功连接至载体；而本专利技术意外发现只有构建的表达SAT2型口蹄疫病
毒结构蛋白VP3的重组枯草芽孢杆菌WB800N/pHT43
‑
VP3，能够诱导机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答，且能够诱导机体产生较高水平的黏膜免疫应答，用于SAT2型口蹄疫黏膜疫苗的制备。具体包括以下内容：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的重组枯草芽孢杆菌WB800N/pHT43
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VP3，所述重组枯草芽孢杆菌WB800N/pHT43
‑
VP3是将编码SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的基因或表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的重组载体/质粒导入枯草芽孢杆菌WB800N获得。
[0008]优选地，所述重组枯草芽孢杆菌WB800N/pHT43
‑
VP3的制备方法为：全基因合成SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3基因；将SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3基因连接至pHT43质粒中，构建重组质粒pHT43
‑
VP3；将重组质粒pHT43
‑
VP3转化枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞获得重组枯草芽孢杆菌WB800N/pHT43
‑
VP3。
[0009]优选地，所述扩增SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3基因的引物为：
[0010]pHT43
‑
VP3
‑
F：atcagccgtaggatccTGCTCTAGAATGGGCATCATCCCGGTCGCTG，其中，小写部分为同源臂基因序列；
[0011]pHT43
‑
VP3
‑
R：tcattaggcgggctgcTCAATGGTGGTGATGGTGATGGGTGATGCTGTCGCACA，其中小写部分为同源臂基因序列；斜体部分为6
×
His标签基因序列。
[0012]优选地，所述SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0013]优选地，所述转化为电转化。
[0014]优选地，所述电转化为：
[0015](1)向枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞中加重组质粒pHT43
‑
VP3，冰浴后加入电转杯，电转仪设置为2.5kv、25μF、2000Ω、持续时间4.5ms，电击1次；
[0016](2)取出电转杯，加入复苏培养基RM，37℃、200rpm复苏3h，取200μL菌液涂布于Cm抗性(10μg/mL)的2
×
YT固体平板培养基上，37℃过夜培养。
[0017]优选地，所述枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞的制备方法为：
[0018](1)挑取枯草芽孢杆菌WB800N单菌落接种于LB培养基中，37℃、200rpm培养18h；
[0019](2)取步骤(1)所述过夜培养物转接至GM液中，使OD
600
＝0.2左右，于37℃、200rpm培养至OD
600
＝1.0左右；
[0020](3)取步骤(2)中的全部菌液冰浴，4℃、5000rpm离心8min，弃掉上层废液，收集下层沉淀中的菌体；
[0021](4)4℃预冷电转缓冲液ETM，每次加入40mL电转缓冲液ETM洗涤步骤(3)所述菌体，4℃、5000rpm离心8min，弃掉上层废液，保留下层沉淀，反复3次；
[0022](5)将步骤(4)洗涤后的菌体重悬于500μL步骤(4)所述的ETM中，
‑
80℃冻存备用。
[0023]第二方面，本专利技术提供了上述第一方面所述的重组枯草芽孢杆菌WB800N/pHT43
‑
VP3在制备SAT2型口蹄疫病毒疫苗中的应用。
[0024]第三方面，本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的重组枯草芽孢杆菌WB800N/pHT43
‑
VP3，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌WB800N/pHT43
‑
VP3是将编码SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的基因或表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的重组载体/质粒导入枯草芽孢杆菌WB800N获得。2.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌WB800N/pHT43
‑
VP3，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌WB800N/pHT43
‑
VP3的制备方法为：全基因合成SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3基因；将SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3基因连接至pHT43质粒中，构建重组质粒pHT43
‑
VP3；将重组质粒pHT43
‑
VP3转化枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞获得重组枯草芽孢杆菌WB800N/pHT43
‑
VP3。3.如权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌WB800N/pHT43
‑
VP3，其特征在于，所述扩增SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3基因的引物为：pHT43
‑
VP3
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F：atcagccgtaggatccTGCTCTAGAATGGGCATCATCCCGGTCGCTG，其中，小写部分为同源臂基因序列；pHT43
‑
VP3
‑
R：tcattaggcgggctgcTCAATGGTGGTGATGGTGATGGGTGATGCTGTCGCACA，其中小写部分为同源臂基因序列；斜体部分为6
×
His标签基因序列。4.如权利要求3所述的重组枯草芽孢杆菌WB800N/pHT43
‑
VP3，其特征在于，所述SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的基因序列如SEQ ID NO.1所示。5.如权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌WB800N/pHT43
‑
VP3，其特征在于，所述转化为电转化。6.如权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，茹毅，陈娇，郝荣增，杨洋，李亚军，刘华南，卢炳州，张贵财，毛玉涵，张越，吴秀萍，赵东梅，任蕊芳，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：