一种提高重组蛋白表达量的方法技术

本发明专利技术涉及一种提高重组蛋白表达量的方法，该方法包括如下步骤：将编码SNARE家族蛋白的基因转入用于表达重组蛋白的细胞中；使SNARE家族蛋白瞬时或稳定表达；所述重组蛋白不为所述SNARE家族蛋白。本发明专利技术提供的方法通过在宿主细胞中过表达SNARE家族蛋白，从而显著提升重组蛋白产量。著提升重组蛋白产量。

【技术实现步骤摘要】
一种提高重组蛋白表达量的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种提高重组蛋白表达量的方法。

技术介绍

[0002]重组蛋白工业生产的常用哺乳动物作为宿主细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是最常用的宿主细胞。尽管CHO细胞已成功地用作制造宿主细胞系统超过30年，但这些细胞系在生长速度和重组蛋白生产能力方面仍然受到一定限制。改善宿主细胞的性能，提高宿主细胞的重组蛋白表达量，一直都是重组蛋白生产领域关注的重点。通过生物分子学方法改造细胞系是常用的提高宿主细胞重组蛋白表达量的方法，现阶段应用于CHO细胞的细胞系改造方法包括：敲除、过表达特定基因以及使用非编码RNA等。这些特定基因涉及蛋白合成、细胞代谢、分泌以及细胞周期等各个细胞通路。
[0003]目前，亟待提供一种提高重组蛋白表达量的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，利用SNARE家族蛋白改造用于表达重组蛋白的细胞，改善其性能。
[0005]第一方面，本专利技术提供一种提高重组蛋白表达量的方法，所述方法包括如下步骤：将编码SNARE家族蛋白的基因转入用于表达重组蛋白的细胞中，进行瞬时或稳定表达；所述重组蛋白不为所述SNARE家族蛋白。
[0006]本专利技术提供的方法通过在宿主细胞中过表达SNARE家族蛋白，从而提升重组蛋白产量。
[0007]在一些实施方式中，所述SNARE家族蛋白包括Sec22b蛋白(SEC22 homolog B,vesicle trafficking protein),Bet1蛋白(Bet1 golgi vesicular membrane trafficking protein)和/或Stx5蛋白(syntaxin 5)。
[0008]在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：将具有编码Sec22b蛋白的基因的载体转入用于表达重组蛋白的细胞中。
[0009]在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：将具有编码Bet1蛋白的基因的载体转入用于表达重组蛋白的细胞中。
[0010]在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：将具有编码Stx5蛋白的基因的载体转入用于表达重组蛋白的细胞中。
[0011]在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：将具有编码Sec22b蛋白和编码Bet1蛋白的基因的载体转入用于表达重组蛋白的细胞中。
[0012]在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：将具有编码Sec22b蛋白和编码Stx5蛋白的基因的载体转入用于表达重组蛋白的细胞中。
[0013]在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：将具有编码Bet1蛋白和编码Stx5蛋白的基因的载体转入用于表达重组蛋白的细胞中。
[0014]在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：将具有编码Bet1蛋白和编码Stx5蛋白的基因的载体转入用于表达重组蛋白的细胞中。
[0015]在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：将具有编码Sec22b蛋白、编码Bet1蛋白和编码Stx5蛋白的基因的载体转入用于表达重组蛋白的细胞中。
[0016]在一些实施方式中，所述基因经过了密码子优化。
[0017]在一些实施方式中，所述载体中还插入了蛋白标签，如Flag标签、Halo标签、SNAP标签、His
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tag标签等。
[0018]在一些实施方式中，所述载体为真核细胞表达载体。作为本专利技术的优选方案，所述载体为pcDNA3.1载体，如pcDNA3.1 Hygro(+)载体。
[0019]在一些实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞，可以选自CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)、HEK293细胞、Vero细胞等。
[0020]在一些实施方式中，所述细胞为CHO细胞，具体可以选用CHO
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K1、CHO
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S、CHO
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DXB11、CHO
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DG44等细胞系。
[0021]在一些实施方式中，所述用于表达重组蛋白的细胞是能够稳定表达重组蛋白的单克隆细胞。
[0022]在一些实施方式中，所述用于表达重组蛋白的细胞是外源转入了重组蛋白表达载体的细胞，所述重组蛋白表达载体可以先于编码Sec22b蛋白、编码Bet1蛋白和/或编码Stx5蛋白的基因或载体转入细胞，也可以与编码Sec22b蛋白、编码Bet1蛋白和/或编码Stx5蛋白的基因或载体共同转入。
[0023]作为本专利技术的一种具体实施方式，所述方法包括如下步骤：合成CHO细胞的编码Sec22b蛋白、编码Bet1蛋白和/或编码Stx5蛋白的基因，优选合成如SEQ ID NO:1所示、如SEQ ID NO:2所示和/或如SEQ ID NO:3所示的基因序列，然后分别构建到pcDNA3.1载体中，将所得载体转染到能够表达重组蛋白的单克隆CHO细胞中。
[0024]作为本专利技术的一种具体实施方式，所述方法包括如下步骤：合成CHO细胞的编码Sec22b蛋白、编码Bet1蛋白和/或编码Stx5蛋白的基因，优选合成如SEQ ID NO:1所示、如SEQ ID NO:2所示和/或如SEQ ID NO:3所示的基因序列，然后分别构建到pcDNA3.1载体中，将所得载体与重组蛋白的表达载体共同转染到CHO细胞中。
[0025]在一些实施方式中，所述重组蛋白选自单克隆抗体(例如：曲妥珠单抗)和融合蛋白。
[0026]在一些实施方式中，所述融合蛋白为Fc融合蛋白，即利用基因工程等技术将某种具有生物活性的功能蛋白分子与免疫球蛋白(IgG、IgA等)的Fc片段融合而产生的蛋白，如TNFR
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Fc融合蛋白等。
[0027]本专利技术行瞬时表达的方法具体为：采用本领域常用的转染方法(例如采用聚醚酰亚胺(PEI)试剂)，将外源的基因或插入了所述外源基因的载体转染到宿主细胞。为了提高转染的效率和细胞的存活率，可以在转染时采用特定的转染培养基。
[0028]本专利技术进行稳定表达的方法具体为：将外源的基因序列插入具有某种抗性的载体上，采用本领域常用的转染方法(例如采用聚醚酰亚胺(PEI)试剂)，将该载体转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，然后用所述载体中所含的抗性筛选标志物如新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)、嘌呤霉素(puromycin)等进行筛选，直至细胞活率恢复
至90％以上，得到稳定表达外源基因的细胞。为了提高转染的效率和细胞的存活率，可以在转染时采用特定的转染培养基。
[0029]第二方面，本专利技术提供一种高表达重组蛋白的细胞，所述细胞能够瞬时或稳定过表达SNARE家族蛋白，所述重组蛋白不为所述SNARE家族蛋白。
[0030]本专利技术提供的细胞能够过表达SNARE家族蛋白，可以显著提高重组蛋白的表达量。
[0031]在一些实施方式中，所述SNARE家族蛋白包括Sec22b蛋白、Bet1蛋白和/或Stx5蛋白。
[0032]在一些实施方式中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高重组蛋白表达量的方法，其特征在于，包括如下步骤：将编码SNARE家族蛋白的基因转入用于表达重组蛋白的细胞中，使SNARE家族蛋白瞬时或稳定表达；所述重组蛋白不为所述SNARE家族蛋白；优选地，所述SNARE家族蛋白包括：Sec22b蛋白,Bet1蛋白和/或Stx5蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将具有编码Sec22b蛋白的基因的载体、具有编码Bet1蛋白的基因的载体和/或具有编码Stx5蛋白的基因的载体，转入用于表达重组蛋白的细胞中；优选地，所述基因经过了密码子优化；和/或，所述载体中还插入了蛋白标签；和/或，所述载体为真核细胞表达载体，优选为pcDNA3.1载体。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为哺乳动物细胞；优选地，所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK293细胞和Vero细胞。4.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为表达重组蛋白的单克隆细胞，或为外源转入了重组蛋白表达载体的细胞；优选地，所述重组蛋白选自单克隆抗体和融合蛋白；所述融合蛋白优选为Fc融合蛋白。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：合成CHO细胞的编码Sec22b蛋白、编码Bet1蛋白和/或编码Stx5蛋白的基因，优选合成如SEQ ID NO:1所示、如SEQ ID NO:2所示和/或如SEQ ID NO:3所示的基因序列，然后分别构建到pcDNA3.1载体中，将所得载体转染到能够表达重组蛋白的单克隆CHO细胞；或者，包括如下步骤：合成CHO细胞的编码Sec22b蛋白、编码Bet1蛋白和/或编码Stx5蛋白的基因，优选合成如SEQ ID NO:1所示、如SEQ ID NO:2所示和/或如SEQ ID NO:3所示的基因序列，然后分别构建到pcDNA3.1载体中，将所得载体与重组蛋白的表达载体共同转染到CHO细胞中。6.高表达重组蛋白的细胞，其特征在于，所述细胞能够瞬时或稳定过表达SNARE家族蛋白，所述重组蛋白不为所述SNARE家族蛋白；优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁千惠，刘阳，
申请(专利权)人：广州汉腾生物科技有限公司佛山普津生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：