多粘芽孢杆菌CPL258及其筛选和应用制造技术

本发明专利技术公开了一株多粘芽孢杆菌CPL258及其筛选和应用，该菌株CPL258经鉴定为多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，已保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏时间为2021年09月13日，保藏编号为CCTCC NO.M20211157。本发明专利技术多粘芽孢杆菌CPL258是一种产芽孢的革兰氏阳性短杆状细菌，可产生具有抑菌作用的抗菌肽类、核苷类物质、抗生素及抗菌蛋白等，且其具有防治动物性埃希氏大肠杆菌导致的猪腹泻，从而增强仔猪免疫力，降低死亡率的作用。综上，本发明专利技术多粘芽孢杆菌CPL258在仔猪饲料应用方面具有广阔的前景。广阔的前景。广阔的前景。

【技术实现步骤摘要】
多粘芽孢杆菌CPL258及其筛选和应用


[0001]本专利技术属于生物技术应用领域，具体涉及一株多粘芽孢杆菌CPL258及其筛选和应用。

技术介绍

[0002]多粘芽孢杆菌于2002年被美国环境保护署列为商业应用微生物之一，也是我国农业部规定免做安全鉴定的一级菌种之一。该种属微生物能在不利条件下形成芽孢，即使在苛刻的胃酸环境中也能保持较高的活性，目前在畜禽生产养殖中具有较为广泛的应用。芽孢杆菌能改善畜禽肠道微生态环境，治疗和预防细菌性肠道疾病，提高动物抗病能力，促进动物生长。以猪腹泻疾病为例，已经有饲料添加多种芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等)提高仔猪的抵抗力，维持其肠道平衡的研究报道。
[0003]多粘芽孢杆菌代谢产物之一为Colistin，一种多组分碱性多肽类抗生素。本项目发现ColistinA是Colistin的成分之一，它可以用来可用来对抗一些由革兰氏阴性菌引起的感染。Colistin A的分子结构如图1所示，它的结构主要由三部分组成，环状7肽包括:4个L
‑
Dab，1个L
‑
Leu,1个L
‑
Thr，1个D
‑
Leu；线性3肽包括:2个L
‑
Dab，1个L
‑
Thr；疏水酰基尾包括:甲基辛酸，异辛酸。分子量约为1169.5g/mol。相对于传统的抗生素，Colistin A具有更高的稳定性，但是Colistin A的产量很低，如何高效生产Colistin A是继续解决的问题。
[0004]Colistin A如下所示：
[0005]
技术实现思路

[0006]专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一株产抗细菌代谢产物的菌株多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CPL258，本专利技术筛选到的多粘芽孢杆菌CPL258可以高产Colistin A，对于猪腹泻埃希氏大肠杆菌疾病具有非常好的效果。
[0007]本专利技术还提供所述多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CPL258的筛选方法和应用。
[0008]技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述一株多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CPL258，已保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏时间为2021年09月13日，保藏编号为CCTCC NO.M20211157。该菌株来源于淮安市水产养殖所附近土壤中，在LB培养基上菌落形态为圆形、表面光滑、稍凸起、边缘不整齐、乳白色、不透明。
[0009]本专利技术所述多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CPL258是一种产芽孢的革兰氏阳性细菌，可产生具有抑菌作用的肽类、核苷类物质、抗生素及抗菌蛋白等；对金黄色葡萄球菌、埃希氏大肠杆菌、鰤鱼诺卡氏菌具有抑制作用。
[0010]本专利技术所述的多粘芽孢杆菌CPL258的筛选方法，包括如下步骤：
[0011](1)取土壤样品与生理盐水混匀，热处理后加入NaCl，水浴后取土壤悬液用无菌水稀释；
[0012](2)取稀释后的稀释液滴加在LB固体培养基上，涂布均匀，培养得到初筛菌株，以分离筛选得到的初筛菌株为供试菌；
[0013](3)以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用牛津杯法筛选出具有金黄色葡萄球菌拮抗效果多粘芽孢杆菌CPL258。
[0014]作为优选，本专利技术所述的多粘芽孢杆菌CPL258的筛选，包括如下步骤：
[0015]将在江苏省淮安市水产养殖所(33.28
′
24,54
″
Net 119.9
′
48,79
″
E)附近选取的10～20cm深处的土壤约10g，加入100ml生理盐水混匀。在80℃条件下水浴1h，再加入4g NaCl，37℃水浴2h。取1mL土壤悬液用无菌水10倍梯度稀释，取100μL稀释后的菌液滴加在LB固体培养基上，涂抹均匀，倒置37℃过夜培养。观察培养基上单个菌落的形态，包括菌落的颜色、大小、菌落边缘以及表面粗糙情况，最终获得86株芽孢杆菌初筛菌株。以分离筛选获得的初筛菌株为供试菌，以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用牛津杯法筛选出金黄色葡萄球菌拮抗效果最好的多粘芽孢杆菌CPL258。
[0016]本专利技术所述的多粘芽孢杆菌CPL258在生产具有抑菌作用的肽类、核苷类物质、抗菌蛋白、抗生素中的应用。
[0017]其中，所述抗生素为Colistin A。
[0018]进一步地，所述多粘芽孢杆菌CPL258接种于发酵培养基中进行发酵，从发酵液中分离获得所述的Colistin A。
[0019]其中，所述发酵培养基的配方为每1L中包括：蛋白胨4.5
‑
5g，玉米浆0.02
‑
0.05L，淀粉8.0
‑
11.0g，(NH4)2SO
4 2.8
‑
3.3g，CaCO
3 10.0
‑
12.0g，K2HPO
4 6.0
‑
8.0g，VB1、VB3、VB5、VB
12
、VH各1
‑
3mg，，pH 7.0
‑
7.2。
[0020]其中，所述发酵条件为通气比5.8
‑
6.2vvm，转速130
‑
180r/min，接种量1.8
‑
2.0％，发酵时间为48小时。
[0021]作为优选，所述菌株多粘芽孢杆菌CPL258接种于培养基中进行发酵的条件为37℃，180rpm恒温培养，发酵时间为48h。
[0022]本专利技术所述的多粘芽孢杆菌CPL258在制备防治猪腹泻病害的生防制剂或饲料中的应用。
[0023]进一步地，所述多粘芽孢杆菌CPL258在制备防治猪腹泻埃希氏大肠杆菌疾病生防制剂或饲料中的应用。
[0024]其中，所述生物制剂或者饲料中含有所述的多粘芽孢杆菌CPL258的菌体、芽孢、发酵液或者由多粘芽孢杆菌CPL258发酵液制备的Colistin A。
[0025]本专利技术的所述多粘芽孢杆菌CPL258具有广谱抑菌性，具有拮抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌的活性。尤其多粘芽孢杆菌CPL258对埃希氏大肠杆菌、鰤鱼诺卡氏菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。本专利技术提供了所述的多粘芽孢杆菌CPL258在针对防治仔猪猪腹泻的猪饲料中的应用，尤其是猪腹泻埃希氏大肠杆菌疾病。本专利技术通过饲喂含有多粘芽孢杆菌CPL258的饲料，感染猪腹泻埃希氏大肠杆菌的仔猪的存活率远高于普通饲料喂养的仔猪。
[0026]本专利技术分离获得一株多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，该菌是一种产芽孢的革兰氏阳性细菌，细胞形态呈短杆状、单生，能产生肽类、核苷类抗菌物质、抗菌蛋白等多种具有抑菌作用的物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CPL258，已保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏时间为2021年09月13日，保藏编号为CCTCC NO.M 20211157。2.一种权利要求1所述的多粘芽孢杆菌CPL258的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取土壤样品与生理盐水混匀，热处理后加入NaCl，水浴后取土壤悬液用无菌水稀释；(2)取稀释后的稀释液滴加在LB固体培养基上，涂布均匀，培养得到初筛菌株，以分离筛选得到的初筛菌株为供试菌；(3)以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用牛津杯法筛选出具有金黄色葡萄球菌拮抗效果多粘芽孢杆菌CPL258。3.一种权利要求1所述的多粘芽孢杆菌CPL258在生产具有抑菌作用的肽类、核苷类物质、抗菌蛋白、抗生素中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗生素优选为Colistin A。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述多粘芽孢杆菌CPL258接种于发酵培养基中进行发酵，从发酵液中分离获得所述的Colistin A。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方为每1L中包括：蛋白胨4.5
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5g，玉米浆0.02
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0....

【专利技术属性】
技术研发人员：王小花，吴静雨，罗楚平，夏雪芹，徐琳，陆晨曦，张金峰，田宝霞，邬章欣，杜未雨，黄宇洁，
申请(专利权)人：淮阴工学院，
类型：发明
国别省市：