本申请本发明专利技术公开了一种用于防治蔬菜菌核病的贝莱斯芽孢杆菌及其应用，所述贝莱斯芽孢杆菌菌株的分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，株号Bv20，保藏号为CCTCC M 2022427。所述贝莱斯芽孢杆菌Bv20及其无细胞上清液对小核盘菌具有显著抑制作用，可用于小核盘菌引起的生菜菌核病的防治，温室盆栽试验防效达72.6％；利用贝莱斯芽孢杆菌Bv20开发的生防剂或生物农药具有很好的应用前景。前景。
【技术实现步骤摘要】
一种用于防治蔬菜菌核病的贝莱斯芽孢杆菌及其应用
[0001]本申请涉及植物病害生物防治
，特别是涉及贝莱斯芽孢杆菌菌株及其在防治生菜菌核病中的应用。
技术介绍
[0002]菌核病是生菜生产上的一种毁灭性的土传病害，是由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和小核盘菌(Sclerotinia minor)引起的，其所造成的平均产量损失在10％～15％，最高可达30％。虽然在我国大多数地区主要的优势种是核盘菌，但在长三角地区，近年来由小核盘菌(Sclerotinia minor)引起生菜菌核病的情况日趋严重。虽然两个病原菌是同属的真菌，但侵染寄主的方式不同。
[0003]小核盘菌能侵染100余种植物，包括莴苣、油菜和生菜等多种经济作物。小核盘菌主要以菌核的形式在土壤、病残体或混在种子中越冬，其生活史循环中约90％的时间以菌核的形态存在。菌核具有抗逆性，可在土壤中存活多年。然而，小核盘菌在自然条件下罕见产生有性阶段，即子囊盘和子囊孢子。来年后，菌核萌发产生菌丝体，以菌丝体形式侵染寄主。小核盘菌在植物的任何生长阶段均能侵染，包括苗期到成株期。在潮湿寒冷的条件下，病原菌能在侵染部位快速蔓延，形成白色絮状菌丝，严重时能导致植物萎蔫死亡，植物的病残体上通常产生大量的菌核，作为新的侵染源。
[0004]相比较，核盘菌具有更为广泛的寄主，能侵染超过400种植物，并能产生黑色无性的菌核，类似于小核盘菌。菌核在缺乏适合的寄主时以静止状态在土壤中存活多年，可作为气传病原菌或作为土传病原菌。地表菌核在适合条件下萌发，产生子囊盘，释放子囊孢子(Clarkson等，2006)，这种萌发称为产果体萌发(Carpogenic germination)。子囊孢子从子囊盘的子囊中强烈地弹射出后，被风传到整个田块或相邻的田块中，侵染地上部分植物。而地下菌核产生菌丝体直接侵染寄主，这种萌发称为产丝体萌发(Myceliogenic germination)。然而，大量研究表明，核盘菌菌核主要是以产果体萌发方式为主，产丝体萌发不超过5％。所以，由核盘菌引起的菌核病，病害发生和流行的预测主要基于子囊孢子接种和环境因子。
[0005]显然，由于两个病原菌生物学特性和侵染寄主的差异，因而在病害防治策略上也是不同的。针对小核盘菌引起的生菜菌核病，防治上主要以防治病原菌菌丝侵染为主，而针对核盘菌引起的生菜菌核病，生产上主要以防治子囊孢子传播和侵入为主。
[0006]由于生菜生产受土地面积的限制，连作常常导致菌核病发生越来越严重，给生菜生产造成了严重的损失。虽然推广抗病品种的防治方法最为经济有效，但目前并未有完全抗病或完全免疫的品种。因此，对菌核病的防治主要依靠化学防治方法。常用的农药有多菌灵、戊唑醇、菌核净等。但由于菌核的抗逆性，不仅防治效果有限，而且易诱导病原菌抗药性的提升。而生物防治具有持效期长、对环境污染小、对农作物和人畜安全等优点。利用生物防治措施防治生菜菌核病有助于保障蔬菜的安全，减少生态污染问题，具有经济和生态双重效益。生防菌的开发和应用，将为防治生菜菌核病提供广阔的市场与前景。
[0007]目前，关于菌核病生物防治的研究多聚焦于核盘菌，发现的生防菌主要集中在盾壳霉(Coniothyrium minitans)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)和芽孢杆菌(Bacillus spp.)等微生物，而小核盘菌的生防研究较少。针对小核盘菌菌核主要以菌丝体萌发，罕见产生子囊盘和子囊孢子这一特性，筛选能够定殖于土壤并能抑制小菌核的萌发及菌丝生长的生防菌株，用其防治由小核盘菌引起的菌核病尤为重要。
[0008]然而，外来的生防菌株在当地土壤存在适应性问题，常影响了生防菌株的生防效果。因此，从当地土壤中筛选高效生防菌株，是开发和利用生防制剂的重要方面和途径。
技术实现思路
[0009]本专利技术旨在解决生菜菌核病的防治困难问题，提供了一株贝莱斯芽孢杆菌菌株、生防剂及其在防治生菜菌核病中的应用。所述贝莱斯芽孢杆菌Bv20对小核盘菌菌丝的生长有较强的抑制作用，能有效抑制小核盘菌在生菜叶片和茎秆上的扩展，利用Bv20开发的生防剂或生物农药具有良好的应用前景。
[0010]一种贝莱斯芽孢杆菌菌株，分类命名为Bacillus velezensis，株号为Bv20，保藏编号为CCTCC M 2022427。
[0011]本专利技术的贝莱斯芽孢杆菌菌株分离于上海春昌蔬果专业合作社生菜地土壤样品，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，株号为Bv20，保藏时间为2022年4月19日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2022427。
[0012]所述贝莱斯芽孢杆菌菌株的生物学及形态学特征：
[0013]所述菌株Bv 20在LB平板上恒温(30℃)培养48h后，其菌落呈圆形，白色，不透明，表明干燥，有褶皱，接菌环轻触有轻微粘性。
[0014]所述贝莱斯芽孢杆菌菌株的遗传学特征：
[0015]所述菌株Bv 20的16s序列如SEQ ID NO：13所示。
[0016]所述菌株Bv 20的五个保守基因：groEL、gryA、polC、purH、rpoB。其中groEL的序列如SEQ ID NO：14所示；gryA的序列如SEQ ID NO：15所示；polC的序列如SEQ ID NO：16所示；purH的序列如SEQ ID NO：17所示；rpoB的序列如SEQ ID NO：18所示。
[0017]本申请还提供一种所述贝莱斯芽孢杆菌菌株在制备用于防治蔬菜菌核病的生防产品中的用途。
[0018]可选的，所述生防产品为生防菌剂、无细胞上清液或生物农药。
[0019]本申请还提供一种生防菌剂，所述生防菌剂的活性成分为如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌。可选的，所述生防菌剂中贝莱斯芽孢杆菌的浓度为1
×
109～1
×
10
10
cfu/mL。
[0020]该生防菌剂由本专利技术分离得到的贝莱斯芽孢杆菌菌株制备得到，制备方法包括：
[0021]将所述贝莱斯芽孢杆菌接种于培养液中培养至培养液OD
600
为0.5～0.8，获得种子液；其中所述培养液可选用LB液体培养基，其配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，去离子水定容至1L，pH 7.2；
[0022]将种子液接种于LB发酵培养基中扩大培养，获得所述生防菌剂。
[0023]其中，所述种子液的接种量优选为1～2％。
[0024]可选的，所述扩大培养在摇床中进行，扩大培养的温度为30℃，转速为180rpm，时间为72h。发酵液培养后得到的菌悬液浓度为1
×
109～10
10
cfu/mL。
[0025]无细胞上清液的制备：将生防细菌液体发酵液经10000rpm离心10min，得到贝莱斯芽孢杆菌B本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种贝莱斯芽孢杆菌菌株，其特征在于，分类命名为Bacillus velezensis，株号为Bv20，保藏编号为CCTCC M 2022427。2.如权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌菌株在制备用于防治蔬菜菌核病的生防产品中的用途。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述生防产品为生防菌剂、无细胞上清液或生物农药。4.一种生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂的活性成分为如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌。5.根据权利要求4所述的生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂中贝莱斯芽孢杆菌的浓度为1
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10
cfu/mL。6.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株或如权利要求4所述的生防菌剂在拮抗小核盘菌中的用途。7.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株或...
【专利技术属性】
技术研发人员：张敬泽，商庆华，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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