产气荚膜梭菌α毒素抗体荧光微球免疫层析检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，具体涉及一种产气荚膜梭菌α毒素抗体荧光微球免疫层析检测试剂盒及其制备方法。试剂盒至少包括试纸条，试纸条由加样端开始依次设有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；结合垫上喷涂有偶联产气荚膜梭菌α毒素截短蛋白的荧光微球；硝酸纤维素膜靠近吸水垫一侧设有质控线，质控线喷涂有鼠源产气荚膜梭菌α毒素截短蛋白的单克隆抗体，靠近加样端一侧设有检测线，检测线喷涂有截短表达的产气荚膜梭菌α毒素蛋白，截短表达的产气荚膜梭菌α毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术实现了对多种动物血清中α毒素抗体检定性与定量的检测，具有广泛实用性。广泛实用性。广泛实用性。

【技术实现步骤摘要】
产气荚膜梭菌
α
毒素抗体荧光微球免疫层析检测试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种产气荚膜梭菌α毒素抗体荧光微球免疫层析检测试剂盒及其制备方法。

技术介绍

[0002]产气荚膜梭菌广泛存在于空气、水、土壤、食品及动物的胃肠道中，是自然界中常见的条件性致病菌，当动物抵抗力下降时即可引起发病，导致动物猝死症，发病急、病程短、死亡率高。近年来，产气荚膜梭菌流行情况较为严重，对羊、兔、猪、鸡、鸭、牛的危害越来越多。α毒素(CPA)是几乎所有类型产气荚膜梭菌都能产生的一种多功能性金属酶，是典型的致死性毒素，因此α毒素是评价产气荚膜梭菌病的重要依据和判定食品安全的重要指标。α毒素的抗体水平也是评价动物机体抵抗梭菌感染能力的重要指标。
[0003]目前，针对产气荚膜梭菌α毒素及抗体的常用检测方法包括微生物学方法、免疫学方法、分子生物学方法。微生物学方法为将处理后的病理样品接种到选择培养基进行分离培养，对疑菌落涂片进行革兰氏染色镜检、生化反应检查、溶血试验以及动物试验；免疫学方法一般采用毒素(血清)中和试验、酶联免疫吸附实验；分子生物学方法为聚合酶链式反应(PCR)。
[0004]常见的血清抗体检测方法有ELISA法、胶体金法。但ELISA法耗时较长，需要酶标仪及专业人员操作，鲍长磊(产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR和α毒素抗体ELISA检测方法的建立及初步应用[D].西北农林科技大学,2016.)建立的羊α毒素抗体间接ELISA方法，检测用时要两个半小时以上；楚国茹、王海荣等(专利技术专利申请CN201310196434.1)建立的用于兔产气荚膜梭菌α毒素抗体捕获ELISA方法，检测用时要2小时15分钟以上；赵蕾、李广兴等(专利技术专利申请CN201510004352.X)建立的单抗阻断ELISA检测方法，检测用时3小时10分钟以上。胶体金法虽方便快捷但灵敏度、稳定性较差，容易产生人为误差。
[0005]荧光微球法是指将直径在纳米到微米之间的球形荧光物质通过物理和化学等方法标记在粒子的表面或包埋在微球内部，具有形状和大小相对稳定、单分散性好、发光效率高、与生物体之间相互作用后产生的各种反应好、吸附性强、比表面积大、表面反应能力强和凝集作用大等优点。微球与抗体或抗原结合后不会对其与相关抗原抗体的反应产生影响。荧光微球检测时受到环境及样品中的溶剂、热、电、磁等的影响小得多。采用较长荧光半衰期的稀土离子作标记物，由于这种标记物Stokes位移大(>150nm)且荧光寿命比本底物质荧光寿命高5～6个数量级，因此，测定时只要延缓测量时间，待本底物质的荧光充分衰减后再测定标记物的信号就可有效地消除各种非特异性荧光的干扰，获得很高的灵敏度。同时荧光微球表面修饰有合适密度的羧基或其它功能基团，用于与蛋白或抗体的共价偶联，提高了标记物的稳定性。将时间分辨荧光微球代替代胶体金作为示踪物，其灵敏度高于普通胶体金或有色乳胶免疫层析方法1～3个数量级。

技术实现思路

[0006]针对ELISA法耗时较长，胶体金法灵敏度、稳定性较差的技术问题，本专利技术提供一种产气荚膜梭菌α毒素荧光微球免疫层析检测试剂盒及其制备方法，通过使用双抗原夹心法检测及特异性单抗做质控线，同时搭配使用荧光微球，实现了对多种动物(羊、兔、猪、鸡、鸭、牛)血清中α毒素抗体的检测，具有广泛实用性，较传统的ELISA方法具有方便快捷的特点，不需要专业人员及贵重的仪器设备，较胶体金的方法具有更高的稳定性与可靠性。
[0007]第一方面，本专利技术提供一种产气荚膜梭菌α毒素荧光微球免疫层析检测试剂盒，至少包括试纸条，试纸条由加样端开始依次设有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；结合垫上喷涂有偶联产气荚膜梭菌α毒素截短蛋白的荧光微球；硝酸纤维素膜靠近吸水垫一侧设有质控线，质控线喷涂有鼠源产气荚膜梭菌α毒素截短蛋白单克隆抗体，靠近加样端一侧设有检测线，检测线喷涂有截短表达的产气荚膜梭菌α毒素蛋白，截短表达的产气荚膜梭菌α毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0008]该试纸条的工作原理为：
[0009]采用免疫层析方法，当进行检测时，若血清样本中存在产气荚膜梭菌α毒素抗体，抗体的Fab片段先被结合垫中荧光微球标记的产气荚膜梭菌α毒素截短蛋白特异性结合，而免疫复合物通过侧向层析的方式流动至硝酸纤维素膜的检测线区域，抗体的另一个Fab片段与检测线上产气荚膜梭菌α毒素截短白结合，完成检测信号。未反应的荧光微球标记产气荚膜梭菌α毒素截短蛋白流动至质控线，与鼠产气荚膜梭菌α毒素截短蛋白单克隆抗体结合。
[0010]进一步的，荧光微球为粒径100～200nm的羧基荧光微球。
[0011]进一步的，荧光微球为时间分辨荧光微球。临床上常使用三联四防疫苗进行防治，时间分辨荧光微球可以实现对血清中产气荚膜梭菌α毒素抗体水平半定量检测。因此，本专利技术可以对动物的α毒素抗体水进行快速检测，为预防该病的发生提供可靠检测数据，与传统的胶体金相比，大大提高了检测灵敏度；同时也可以对疫苗免疫水平监测，指导免疫。
[0012]进一步的，还包括样品稀释液，样品稀释液为含有终浓度为0.1％(V/V)～1％(V/V)曲拉通
‑
100的Tris溶液，Tris溶液的摩尔浓度为0.1～1M。
[0013]第二方面，本专利技术提供一种上述产气荚膜梭菌α毒素抗体荧光微球免疫层析检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
[0014]步骤一，制备硝酸纤维素膜：将截短表达的产气荚膜梭菌α毒素蛋白喷涂在检测线，将鼠源产气荚膜梭菌α毒素截短蛋白单克隆抗体喷涂在质控线，在33℃烘干30min；
[0015]步骤二，制备结合垫：取标记好产气荚膜梭菌α毒素截短蛋白的荧光微球均匀喷涂在结合垫上，33℃烘干30min；
[0016]步骤三，组装试纸条：将硝酸纤维素膜粘贴在试纸条底片上，吸水垫粘贴在靠近质控线一端与硝酸纤维素膜交叠0.5～1mm；结合垫粘贴在靠近检测线一端与硝酸纤维素膜交叠0.5～1mm；样品垫粘贴在结合垫另一端，并与结合垫交叠0.5～1mm。
[0017]进一步的，步骤一中，质控线喷涂的鼠源产气荚膜梭菌α毒素截短蛋白单克隆抗体浓度为0.1～1mg/mL；检测线喷涂的截短表达的产气荚膜梭菌α毒素蛋白浓度为0.5～2mg/mL。
[0018]进一步的，步骤二中，结合垫喷涂的荧光微球的浓度为10～40μg/mL。
[0019]进一步的，还包括步骤四，组装试剂盒：将试纸条切分后装入外壳底板，压紧外壳上盖，然后装入铝箔袋，并加入干燥剂密封保存。
[0020]本专利技术的有益效果在于：
[0021]将特异性单克隆抗体喷涂在质控线位置，通过T(检测线数值)/C(质控线数值)的比值进行定量结果测定，因单克隆抗体具有高特异性，使得建立的检测方法具有更高的可靠性；同时荧光免疫微球技术又赋予快速、敏感等特性，使得本专利技术试剂盒具有简便、灵敏、稳定、稳定等特点，并且可以用于多种动物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产气荚膜梭菌α毒素荧光微球免疫层析检测试剂盒，其特征在于，至少包括试纸条，试纸条由加样端开始依次设有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；结合垫上喷涂有偶联产气荚膜梭菌α毒素截短蛋白的荧光微球；硝酸纤维素膜靠近吸水垫一侧设有质控线，质控线喷涂有鼠源产气荚膜梭菌α毒素截短蛋白单克隆抗体，靠近加样端一侧设有检测线，检测线喷涂有截短表达的产气荚膜梭菌α毒素蛋白，截短表达的产气荚膜梭菌α毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.如权利要求1所述的产气荚膜梭菌α毒素荧光微球免疫层析检测试剂盒，其特征在于，荧光微球为粒径100～200nm的羧基荧光微球。3.如权利要求1所述的产气荚膜梭菌α毒素荧光微球免疫层析检测试剂盒，其特征在于，荧光微球为时间分辨荧光微球。4.如权利要求1所述的产气荚膜梭菌α毒素荧光微球免疫层析检测试剂盒，其特征在于，还包括样品稀释液，样品稀释液为含有终浓度为0.1％(V/V)～1％(V/V)曲拉通
‑
100的Tris溶液，Tris溶液的摩尔浓度为0.1～1M。5.一种如权利要求1所述的产气荚膜梭菌α毒素荧光微球免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金良，李通，孟卫琴，陈金龙，沈志强，马力，孙翠平，李振伟，贾娟，
申请(专利权)人：山东省滨州畜牧兽医研究院，
类型：发明
国别省市：