一种用于亚精胺合成的基因及高产亚精胺菌株的构建制造技术

本发明专利技术公开了一种用于亚精胺合成的基因及高产亚精胺菌株的构建，属于生物技术领域。本发明专利技术在大肠杆菌中表达了来源于里氏木霉的甲硫氨酸脱羧酶基因speD，并在大肠杆菌中过表达内源的speE、speF和metK，敲除亚精胺代谢途径中的亚精胺乙酰转移酶speG和亚精胺吸收转运体PotD，异源表达来源于鲍曼不动杆菌中负责多胺类物质外泌的蛋白AmvA，构建得到了能够高效合成亚精胺的重组大肠杆菌BWΔGΔD

【技术实现步骤摘要】
一种用于亚精胺合成的基因及高产亚精胺菌株的构建


[0001]本专利技术涉及一种用于亚精胺合成的基因及高产亚精胺菌株的构建，属于生物


技术介绍

[0002]亚精胺(三盐酸亚精胺，C7H
19
N3,Spermidine)是含有3个氨基的低分子量脂肪族含氮碱，是存在于所有生物体中的天然多胺之一。亚精胺普遍存在于动植物以及微生物细胞中，它是一类带正电的烷基胺类聚合阳离子，极易与带负电的分子——DNA、RNA、蛋白质和脂质等结合。研究表明，亚精胺的大部分生物学功能是通过与DNA、RNA和蛋白质等带负电的生物分子的静电反应来完成的。由于亚精胺对核酸高的亲和力，它能中和磷酸主链中一部分负电荷从而稳定DNA和RNA，并且亚精胺还参与细胞生长、增殖和死亡等重要的生命过程。另外，研究发现亚精胺能有效激活细胞的自噬作用，再次证明亚精胺对细胞衰老具有重要调控作用和功能。临床研究表面，亚精胺能保护心血管疾病，预防癌症和消炎。亚精胺作为一种无毒的天然物质，功能强大，将其作为一种新型预防和抗衰老的药剂具有相当大的潜力。目前已有亚精胺的膳食补充剂投放市场，但是通过从小麦胚芽中化学提取得到，过程复杂并且产量低，所以如何大量生产安全天然的亚精胺成为亟待解决的问题。
[0003]目前有关亚精胺生物合成的研究很少，南京工业大学利用大肠杆菌表达亚精胺合成所需的酶并采用酶液催化的方法得到亚精胺，亚精胺产量为3.7g/L，但由于底物SAM价格昂贵，不适合大规模生产(Atwo
‑
enzyme cascade system for the bio
‑
production of spermidine from putrescine，公开于2021年)。所以在大肠杆菌中实现亚精胺高效生物合成并实现其外泌是亟待解决的问题。亚精胺在大肠杆菌中存在两条合成途径(如图1)，分别是鸟氨酸途径和精氨酸途径，前者鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶(Ornithine Decarboxylase,ODC)作用下生成腐胺，后者精氨酸在精氨酸脱羧酶(Arginine Decarboxylase,ADC)作用下生成胍丁胺(Agmatine)，进而生成腐胺，腐胺在亚精胺合成酶(Spermidine Synthase)作用下接受S
‑
腺苷甲硫氨酸(S
‑
Adenosyl Methionine,SAM)在S
‑
腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S
‑
Adenosylmethionine Decarboxylase)作用下生成的氨丙基从而得到亚精胺。亚精胺合成途径的实现涉及几个关键酶基因：鸟氨酸脱羧酶基因(speF)、亚精胺合成酶基因(speE)、S
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(metK)、S
‑
腺苷甲硫氨酸脱羧酶(speD)。虽然亚精胺的合成途径是比较明晰的，但目前仍然缺少高效的酶、使得生物法生产亚精胺的效率还不高。

技术实现思路

[0004]本专利技术选择大肠杆菌为表达代谢宿主，通过表达亚精胺合成通路的关键基因，阻断亚精胺的降解的同时增强亚精胺的外泌，实现高效合成，满足市场对于亚精胺的需求。
[0005]本专利技术首先从不同物种来源的亚精胺合成过程中的关键基因——甲硫氨酸脱羧酶基因(S
‑
adenosylmethionine decarboxylase,speD)中，候选的物种包括玉米、大肠杆菌、酿酒酵母、人等，筛选得到来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的甲硫氨酸脱羧酶基因
(TrspeD)，该酶的催化活性显著高于目前已报道的其他物种来源的甲硫氨酸脱羧酶。并通过优化亚精胺在大肠杆菌内的摄取、合成、降解和外泌过程，在大肠杆菌中构建高效亚精胺合成途径，建立高效合成亚精胺的细胞工厂。
[0006]其次，首次将鲍曼不动杆菌的AmvA(multidrug efflux MFS transporter AmvA)基因应用到大肠杆菌亚精胺合成中，使亚精胺胞外分泌量显著提高。S
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶(metK)
[0007]最后将上并通过一系列合成通路优化：过表达大肠杆菌来源的speE、speF、metK和木霉来源的speD等关键酶基因，敲除亚精胺代谢途径中的亚精胺乙酰转移酶(Acetyl
‑
spermidine，speG)和亚精胺转运体potD，过表达负责多胺类物质外泌的蛋白AmvA。由此构建一株亚精胺高效生物合成工程菌BWΔGΔD
‑
DEFK
‑
A，摇瓶培养亚精胺产量达347mg/L，发酵罐培养亚精胺产量达到2.11g/L，实现大肠杆菌中亚精胺的高效分泌，生产过程简单且原料易得成本低，具有良好的工业化应用前景。
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种合成亚精胺的重组大肠杆菌，异源表达里氏木霉来源的甲硫氨酸脱羧酶基因speD，并过表达内源的亚精胺合成酶基因speE和鸟氨酸脱羧酶基因speF。
[0009]优选地，利用pBAD/HisA质粒串联表达所述speD、speE和speF。
[0010]优选地，所述speE和speF均来源于大肠杆菌，(Gene ID:947726)，speD来源于里氏木霉；所述speD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述speE和speF的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和3所示。
[0011]在一种实施方式中，在表达speD、speE、speF的质粒上表达S
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶基因metK。
[0012]优选地，所述metK来源于大肠杆菌，metK的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013]在一种实施方式中，在大肠杆菌基因组中敲除亚精胺乙酰转移酶基因speG；所述speG基因的Gene ID:946117。
[0014]在一种实施方式中，表达MdtJI基因或AmvA基因以增强亚精胺的外泌能力。
[0015]在一种实施方式中，利用pZH粒表达所述MdtJI基因或AmvA基因，pZH质粒是在pBAD/HisA基础进行改造将原本的pBR322复制起点换成p15A复制起点，将氨苄抗性换成氯霉素抗性。
[0016]优选地，所述AmvA基因来源于鲍曼不动杆菌，其Gene ID:66396847，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
[0017]或者所述MdtJI基因来源于大肠杆菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0018]在一种实施方式中，敲除亚精胺吸收转运体蛋白基因potD，其Gene ID：945682。
[0019]在一种实施方式中，所述大肠杆菌的出发菌株优选为大肠杆菌BW25113。
[0020]本专利技术的第二个目的是提供生产亚精胺的方法，所述方法是利用所述重组大肠杆菌，以鸟氨酸和甲硫氨酸为底物转化生产亚精胺。
[0021]在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，异源表达里氏木霉来源的甲硫氨酸脱羧酶基因，并过表达内源的亚精胺合成酶基因和鸟氨酸脱羧酶基因。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，利用质粒串联表达所述甲硫氨酸脱羧酶基因、亚精胺合成酶基因和鸟氨酸脱羧酶基因，可选地，在此质粒上同时表达S
‑
腺苷甲硫氨酸合成酶基因。3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，在大肠杆菌基因组中敲除亚精胺乙酰转移酶基因。4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，表达鲍曼不动杆菌来源的AmvA基因或大肠杆菌来源的MdtJI基因；所述AmvA基因的Gene ID:66396847。5.根据权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，敲除亚精胺吸收转运体蛋白基因potD，所述基因potD的Gene ID：945682。6.一种生产亚精胺的方法，其特征在于，利用权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌，以鸟氨酸和甲硫氨酸为底物转化生产亚精胺。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌培养至OD
600
＝3

【专利技术属性】
技术研发人员：张山，丁利平，
申请(专利权)人：深圳中科欣扬生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：