蛋白粘合剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物材料领域，尤其涉及蛋白粘合剂及其制备方法和应用。本发明专利技术提供了蛋白粘合剂包括：融合蛋白和鲑鱼精DNA；上述融合蛋白包括：生长因子和类弹性蛋白。本发明专利技术通过基因重组技术合成EGF

【技术实现步骤摘要】
蛋白粘合剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物材料领域，尤其涉及蛋白粘合剂及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]针对外科手术中伤口闭合处理过程容易产生二次损伤、感染、瘢痕等问题，用于伤口闭合、止血和愈合的外科组织粘合剂作为缝合等传统伤口闭合的潜在替代品，具有良好的应用前景。目前临床所使用的第一代组织粘合剂主要有纤维蛋白胶、白蛋白
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戊二醛(BioGlues)、氰基丙烯酸酯胶、聚乙二醇(PEG)基对应物等。然而，氰基丙烯酸酯胶生物相容性及生物降解性较差，纤维蛋白胶组织粘附强度(<20kPa)低。此外，包括纤维蛋白胶在内的其他天然来源的粘合剂具有以共价形式交联固化时需要预处理、操作繁琐等缺点，在一定程度上限制了其在临床上的广泛应用。因此，迫切需要开发出一种具有良好的细胞相容性、生物可降解性以及粘附性能的生物粘合剂。
[0003]研究表明，海洋类粘合剂中沙塔蠕虫可通过聚阴阳离子复合凝聚发生液液相分离产生粘合剂，类弹性蛋白亦可通过调节pH、温度、第四位氨基酸种类来调控其发生复合凝聚，且具有良好的生物相容性，已被证实在生物材料中具有较大应用前景。
[0004]伤口愈合过程中多种生长因子在促进细胞增殖和迁移、细胞外基质沉积、血管生成和组织重塑等方面发挥着至关重要的协同作用。生长因子治疗法已得到人们广泛关注，目前已开发出多种生物相容性材料与生长因子相结合的伤口敷料，如壳聚糖、胶原蛋白、海藻酸盐、聚氨酯等。其中，表皮生长因子(EGF)可与细胞表面EGF受体(EGFR)结合，激活一系列的细胞内信号传导途径，进而促进细胞迁移和增殖。然而，EGF在大肠杆菌中表达产量较低，很难在体外大量制备。此外，由于体内蛋白酶的水解作用，以液体等形式局部应用EGF以及负载EGF的伤口敷料仍存在较大局限性。
[0005]因此，开发具有优异粘合性能、良好生物相容性且能促进伤口愈合的蛋白粘合剂对临床上伤口无瘢痕闭合处理具有重大意义。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了蛋白粘合剂及其制备方法和应用。本专利技术通过基因重组技术合成EGF
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ELP，利用蛋白与DNA之间发生的液液相分离，制备出一种具有良好的细胞相容性、生物可降解性以及粘附性能的蛋白粘合剂。本专利技术的蛋白粘合剂在亲疏水表面以及动物组织上均具有优异的粘合性能，能够促进细胞的增殖和迁移，可用于伤口止血并促进伤口愈合。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了蛋白粘合剂包括：融合蛋白和鲑鱼精DNA；
[0009]上述融合蛋白包括：生长因子和类弹性蛋白(ELP)。
[0010]在本专利技术的一些实施方案中，上述鲑鱼精DNA片段大小为～2000bp。
[0011]在本专利技术的一些实施方案中，上述生长因子为表皮生长因子(EGF)。
[0012]在本专利技术的一些实施方案中，上述蛋白粘合剂中的所述融合蛋白与所述鲑鱼精DNA的摩尔比为1:(0.5～2)。
[0013]在本专利技术的一些实施方案中，上述蛋白粘合剂中的所述融合蛋白与所述鲑鱼精DNA的摩尔比为1:1。
[0014]在本专利技术的一些实施方案中，上述蛋白粘合剂中的所述类弹性蛋白包含n个重复的五肽序列GKGVP，其中n为≥18的整数。
[0015]在本专利技术的一些实施方案中，上述n为72，即带有72个正电荷。
[0016]在本专利技术的一些实施方案中，上述的蛋白粘合剂中所述融合蛋白具有：
[0017](1)、如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或
[0018](2)、在如(1)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
[0019](3)、与如(1)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
[0020]在本专利技术的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:1的序列为：MNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRMGAGP[(GVGVP)(GKGVP)9]8GWPH6。
[0021]在本专利技术的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:2的序列为：MNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRMGAGP[(GVGVP)(GKGVP)9]4GWPH6。
[0022]在本专利技术的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:3的序列为：MNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRMGAGP[(GVGVP)(GKGVP)9]12
GWPH6。
[0023]在本专利技术的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:4的序列为：MNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRMGAGP[(GVGVP)(GKGVP)9]16
GWPH6。
[0024]在本专利技术的一些实施方案中，上述的蛋白粘合剂中编码所述融合蛋白的核酸分子具有：
[0025](4)、如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；或
[0026](5)、与(4)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(4)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
[0027](6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(4)或(5)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
[0028]在本专利技术的一些实施方案中，上述的蛋白粘合剂中所述生长因子具有：
[0029](7)、如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；或
[0030](8)、在如(7)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
[0031](9)、与如(7)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
[0032]在本专利技术的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:9的序列为：MNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR。
[0033]本专利技术提供了上述蛋白粘合剂的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0034]S1：构建上述生长因子的引物，PCR扩增，获得基因元件；
[0035]S2：取上述基因元件与上述类弹性蛋白的表达载体经酶切后进行同源重组，获得
蛋白表达载体；
[0036]S3：取上述蛋白表达载体转化，筛选，进而培养、诱导表达，纯化，获得上述融合蛋白。
[0037]在本专利技术的一些实施方案中，上述蛋白粘合剂的制备方法，包括：取上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.蛋白粘合剂，其特征在于，所述蛋白粘合剂包括：融合蛋白和鲑鱼精DNA；所述融合蛋白包括：生长因子和类弹性蛋白。2.如权利要求1所述的蛋白粘合剂，其特征在于，所述融合蛋白与所述鲑鱼精DNA的摩尔比为1:(0.5～2)。3.如权利要求1或权利要求2所述的蛋白粘合剂，其特征在于，所述类弹性蛋白包含n个重复的五肽序列GKGVP，其中n为≥18的整数。4.如权利要求1至3任一项所述的蛋白粘合剂，其特征在于，所述融合蛋白具有：(1)、如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或(2)、在如(1)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或(3)、与如(1)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。5.如权利要求1至4任一项所述的蛋白粘合剂，其特征在于，编码所述融合蛋白的核酸分子具有：(4)、如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；或(5)、与(4)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(4)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或(6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(4)或...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘凯，李铭，柳柏梅，李敬敬，张洪杰，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：