一种嵌合纤维小体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及复合酶技术领域，尤其涉及一种嵌合纤维小体及其应用。所述嵌合纤维小体由漆酶、过氧化物酶和溶解性多糖单加氧酶组装而成。本发明专利技术通过将漆酶、过氧化物酶和溶解性多糖单加氧酶组装成嵌合纤维小体形式的复合酶，克服了漆酶和过氧化物酶复配时反而导致过氧化物酶的活性下降的缺陷，克服了过氧化物酶和溶解性多糖单加氧酶复配时降解的木质素底物范围有限的缺陷，得到一种同时具备较高的木质素降解酶体系的稳定性和木质素底物降解活性的复合酶，以实现生物质能源转化体系中的木质素无害化降解以及纤维素乙醇有效转化。素无害化降解以及纤维素乙醇有效转化。素无害化降解以及纤维素乙醇有效转化。

【技术实现步骤摘要】
一种嵌合纤维小体及其应用


[0001]本专利技术涉及复合酶
，尤其涉及一种嵌合纤维小体及其应用。

技术介绍

[0002]木质素是构成植物细胞壁的主要成分，是自然界含量最高且难以降解的芳香族聚合物。以木质纤维素为原料生产清洁可再生能源——纤维素乙醇时，预处理原料中的木质素不仅会干扰纤维素酶对底物的水解效率，还会通过疏水作用、静电作用、氢键作用与纤维素酶发生不可逆吸附作用，致使同步糖化发酵反应体系中的酶活性降低，生产成本提升。因此，“无害化去木质素”对于提高酵母抗逆性及纤维素乙醇发酵的生产效率，降低工艺成本，乃至减少生产过程中有毒有害物质的排放都具有重要的实践意义。
[0003]木质素的基本结构单元是苯基丙烷，其通过化合键连接形成芥子醇、松伯醇、5羟基
‑
松柏醇和香豆醇等前体物质，再由后者聚合成复杂酚类聚合物。目前已知的微生物降解木质素的酶系统主要包括木质素降解酶(lignin
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modifying enzymes，LME)和木质素降解辅助酶(lignin
‑
degrading auxiliary enzymes，LDA)两大类。
[0004]研究发现，相对于细菌，真菌具有相对更为强大的木质素解聚酶系统。并且，真菌对木质素的高效降解主要是基于木质素降解酶系的协同作用完成。其中，漆酶(Laccase，Lac)与过氧化物酶(Peroxidases)在降解木质素复杂酚类聚合物的过程中发挥了重要作用。漆酶能够作用于单酚类化合物、双酚类化合物、氨基酚类化合物等低氧化还原电位的酚类以及芳香胺，而过氧化物酶则可作用除了低氧化还原电位酚类之外的高氧化还原电位酚类以及非酚类物质。当漆酶以酚类底物进行催化时，可从被氧化的酚类分子中提取一个电子促发自由基产生，进而引起共价键(特别是烷基
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芳香基)的断裂，造成木质素多聚体的解聚。最终木质素大分子降解产生大量芳香族化合物，漆酶仍可继续将其作为底物，进行芳香环脱甲氧基、脱甲基作用的酶促水解。过氧化物酶作为另一种重要的木质素氧化酶，主要包括木质素过氧化物酶(lignin peroxidases,LiP)，锰过氧化物酶(manganese peroxidases,MnP)和多功能过氧化物酶(versatile peroxidases,VP)等。其中，多功能过氧化物酶(VP)可兼具木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)的生物学催化特性，其催化反应途径可产生具较高氧化还原电势的自由基，进而引发自由基链式反应，该反应又作用于木质素，产生C
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C键或C
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O键断裂、脱甲基、羟基化、苄醇氧化等多种反应，这些产物进一步经不同代谢过程被彻底降解为CO2和H2O，最终达到降解木质素的目的；此外VP还可直接氧化氢醌和取代酚，这两种底物是其他类型的过氧化物酶都难以有效氧化。
[0005]但是单独使用漆酶仍然存在一定的问题：1、不能催化具有
‑
O
‑
4和5
‑5’
的非酚型木质素结构单元；2、酶解的效率有限，并且倾向于“聚合”反应，特别是植物漆酶；3、为了改善单一漆酶的催化水解效率，一些团队试图探究在介质(如ABTS、NHA、TEMPO等)的帮助下来催化转化非酚木质素，但是这些介质均存在毒性，且中间体稳定性差、生产成本高。
[0006]现有技术为了提高木质素降解酶的降解效率，研究了多种酶的复配方式，例如通过漆酶和过氧化酶搭配促进木质素的降解，但是由于漆酶催化过程产生的氧化剂相对不
足，致使过氧化物酶的酶活性下降。例如同时采用漆酶和溶解性多糖单加氧酶，但是这样反而提高了纤维素的强度，导致纤维素的转化率下降。例如同时采用过氧化物酶和溶解性多糖单加氧酶，但是降解的木质素底物范围有限。例如采用溶解性多糖单加氧酶和纤维素酶促进了纤维素酶的纤维素分解效率，但是溶解性多糖单加氧酶并不主导木质素的降解，不能优化纤维素乙醇的发酵体系。【老师，您好，一般不建议在稿件中标注参考文献的出处】

技术实现思路

[0007]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种嵌合纤维小体及其应用，通过嵌合漆酶、过氧化物酶和溶解性多糖单加氧酶组装得到一种同时具备较高的木质素降解酶体系的稳定性和木质素底物降解活性的复合酶。
[0008]第一方面，本专利技术提供一种嵌合纤维小体，所述嵌合纤维小体由漆酶、过氧化物酶和溶解性多糖单加氧酶组装而成。
[0009]嵌合纤维小体是依据天然纤维小体结构，依赖粘连模块(Cohesin)与对接模块(Dockerin)的种间特异性识别及高亲和性的蛋白分子组装基础，经过人工设计在异源细胞表达的微型纤维小体结构(Mini
‑
cellulosome)。其中支架蛋白(Scaffoldin)由不同微生物来源的粘连模块组成，酶蛋白则通过其C端的对接模块与粘连模块之间的特异性高亲和力介导组装到支架蛋白上，最终组成“复合酶系统”。这样的结构可以保证多个酶解反应过程中的上一步反应产物不需要扩散就能直接进入下一步反应的酶蛋白活性中心成为酶解底物，使酶解反应效率得以提高，即形成“底物通道效应”(Substrate
‑
channeling effect)。底物通道效应具有促进反应进行，避免不利的反应平衡和动力学过程，保护不稳定的反应中间物等诸多优点，而纤维小体支架蛋白的柔韧性有效地克服了相邻各种酶组分间的空间位阻效应，为酶促反应中底物通道作用提供保障，增强了多种酶组分之间的协同作用和酶与底物的邻近效应，从而赋予了嵌合酶的高效催化特征。
[0010]由于木质素降解酶系中的Lac主要作用于低氧化还原电位的酚类化合物且具有反应速率快的特征，而VP则主要作用于低/高氧化还原电位的酚类和非酚类物质但反应速率较慢，因此将木质素降解酶Lac、VP和LPMO蛋白组装在嵌合纤维小体结构中，可通过Lac和VP同步催化降解低/高氧化还原电位的底物，将释放的产物如酚类和低分子量木质素衍生物化合物作为电子供体，能够提高LPMO活性和纤维素的水解效率。而在LPMO催化过程产生的H2O2又供给VP和Lac催化反应，优先用于木质素氧化。
[0011]本专利技术基于构建纤维小体嵌合酶系的理念，为酶促反应中底物通道作用提供保障，增强多种酶组分之间的协同作用，以及酶与底物的邻近效应，将漆酶、过氧化物酶和溶解性多糖单加氧酶组装形成一种嵌合纤维小体，其可降解木质素中的多种酚类和非酚类成分，以及其中的低/高氧化还原电位成分，实现木质素充分地无公害化降解，同时在导入酿酒酵母中之后，不仅够提高菌株在同步糖化发酵反应体系中的抗逆性和发酵性能，同时可以作为一种商业化纤维素酶的辅助酶系使用，在不增加额外添加纤维素酶的情况下，提高底物利用率和乙醇产率。
[0012]进一步地，采用支架蛋白组装所述漆酶、过氧化物酶和溶解性多糖单加氧酶；所述支架蛋白包括至少三个粘连模块。
[0013]进一步地，所述组装为通过所述粘连模块和对接模块将所述漆酶、过氧化物酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嵌合纤维小体，其特征在于，所述嵌合纤维小体由漆酶、过氧化物酶和溶解性多糖单加氧酶组装而成。2.根据权利要求1所述的嵌合纤维小体，其特征在于，采用支架蛋白组装所述漆酶、过氧化物酶和溶解性多糖单加氧酶；所述支架蛋白包括至少三个粘连模块。3.根据权利要求1或2所述的嵌合纤维小体，其特征在于，所述组装为通过所述粘连模块和对接模块将所述漆酶、过氧化物酶和溶解性多糖单加氧酶组装至所述支架蛋白上；所述粘连模块来源于热线梭菌、解纤维梭菌或生黄瘤胃球菌中的一种或多种。4.根据权利要求3所述的嵌合纤维小体，其特征在于，所述粘连模块为CipA、ScaB或CipC中的一种或多种，所述对接模块为Doc
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CipA、Doc
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ScaB和Doc
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CipC或多种。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的嵌合纤维小体，其特征在于，所述漆酶、过氧化物酶和溶解性多糖单加氧酶的质量比为1：(0.5～2)：(0.5～2)。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：田沈，杨秀山，杜济良，孔冬冬，
申请(专利权)人：首都师范大学，
类型：发明
国别省市：