一种短链脱氢酶的突变体、编码基因及编码基因获得方法、突变体的应用技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种短链脱氢酶的突变体，所述突变体为突变体L104A、突变体A150Y、突变体Y155A、突变体I158A、突变体I202A或者突变体T205A；所述短链脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术的短链脱氢酶突变体相对野生型短链脱氢酶有更高的酶活性，可以泼尼松或者配合水解酶以醋酸泼尼松为底物制备泼尼松龙，底物的转化率高，产物的收率高，无副产物产生，而且反应可在更高的底物浓度水平下进行，适宜规模化生产。适宜规模化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种短链脱氢酶的突变体、编码基因及编码基因获得方法、突变体的应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种短链脱氢酶的突变体、编码基因及编码基因获得方法、突变体的应用

技术介绍

[0002]泼尼松龙为肾上腺皮质激素类药物，主要用于治疗各种急性严重细菌感染、严重过敏性疾病，胶原性疾病，风湿、类风湿性关节炎，严重支气管哮喘等，而且泼尼松龙作为重要的甾体化合物，还可作为地索奈德、布地奈德等奈德类药物前体，市场潜力巨大。
[0003]目前泼尼松龙的制备主要有化学法和生物发酵法两种。化学法主要是以甾体母核或氢化可的松为原料经过多步的化学合成步骤得到泼尼松龙，如中国专利文献CN101397324A、CΝ101397324A、CΝ1361108A等采用化学方法合成泼尼松龙，但是化学方法普遍存在工艺路线长、工艺流程复杂，生产周期比较长，总收率较低以及对环境不友好等缺点，使得泼尼松龙的生产成本居高不下。
[0004]生物发酵法相对化学合成法具有更佳的环境友好性，如中国专利文献CN102206696A和CN101760495A中公开了微生物发酵和细胞转化制备泼尼松龙。但是生物发酵方法通常涉及菌种选择、发酵、转化和提纯等多个步骤，存在着底物浓度低、转化时间久(一般大于60小时)、转化率和收率都比较低、分离纯化比较困难等缺点。而专利号CN 107058444 A的生物酶法虽避免了上述问题，但采用氢化可的松为原料，存在原料成本过高等缺点。因此开发更具有生产可行性的生物法是泼尼松龙制备技术发展的重要方向。
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技术实现思路

[0005]针对现有生物法制备泼尼松龙的底物浓度低、转化率低等问题，本专利技术的目的在于提供一种短链脱氢酶的突变体，可以醋酸泼尼松或泼尼松为底物转化制备泼尼松龙，底物浓度可以处于更高的水平，而且底物转化率高、产物收率高。
[0006]本专利技术提供如下的技术方案：一种短链脱氢酶的突变体，所述突变体为短链脱氢酶的第104位的亮氨酸突变为丙氨酸的突变体L104A，或者第150位的丙氨酸突变为酪氨酸的突变体A150Y，或者第155位的酪氨酸突变为丙氨酸的突变体Y155A，或者第158位的异亮氨酸突变为丙氨酸的突变体I158A，或者第202位的异亮氨酸突变为丙氨酸的突变体I202A，或者第205位的苏氨酸突变为丙氨酸的突变体T205A；所述短链脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]专利技术人团队在研究中发现，氨基酸序列为SEQ ID NO.1的短链脱氢酶在特定的位置上发生突变得到的突变体，可以泼尼松或配合水解酶以醋酸泼尼松为底物制备泼尼松
龙，相对该野生型短链脱氢酶具有更高的酶活性，底物转化率和产物收率都提到提升，没有其它副产物生成，而且底物浓度相对现有的生物发酵法可处于更高的水平，更适宜规模化生产，其中野生型短链脱氢酶的突变主要是L104A、A150Y、Y155A、I158A、I202A、T205A，优选I158A、I202A，更优选I158A，其对醋酸泼尼松的转化率可以达到98％以上，是野生型的短链脱氢酶的1.57倍，产物泼尼松龙的产率可以达到98％以上。
[0008]其中，短链脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：MNEKFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREIAYHLAKMGAHVVVTARSKEALQKVVARCLELGAASAHYIAGSMEDMTFAEELVAEAGNLMGGLDMLILNHVLYNRLSFFHGEIDNVRKSMEVNFHSFVVLSVAAMPMLMQSQGSIAVVSSVAGKITYPLIAPYSASKFALDGFFSTLRSEFLVNKVNVSITLCILGLIDTETAIKATSGIYLGPASPKEECALEIIKGTALRQDEMYYVGSRWVPYLLGNPGRKIMEFLSATEYNWDNVLSNEKLY*。
[0009]各突变体的氨基酸序列如下：突变体L104A氨酸序列SEQ ID NO.2：MNEKFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREIAYHLAKMGAHVVVTARSKEALQKVVARCLELGAASAHYIAGSMEDMTFAEELVAEAGNLMGGLDMLILNHVLYNRASFFHGEIDNVRKSMEVNFHSFVVLSVAAMPMLMQSQGSIAVVSSVAGKITYPLIAPYSASKFALDGFFSTLRSEFLVNKVNVSITLCILGLIDTETAIKATSGIYLGPASPKEECALEIIKGTALRQDEMYYVGSRWVPYLLGNPGRKIMEFLSATEYNWDNVLSNEKLY*；突变体A150Y氨酸序列SEQ ID NO.3：MNEKFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREIAYHLAKMGAHVVVTARSKEALQKVVARCLELGAASAHYIAGSMEDMTFAEELVAEAGNLMGGLDMLILNHVLYNRLSFFHGEIDNVRKSMEVNFHSFVVLSVAAMPMLMQSQGSIAVVSSVYGKITYPLIAPYSASKFALDGFFSTLRSEFLVNKVNVSITLCILGLIDTETAYKATSGIYLGPASPKEECALEIIKGTALRQDEMYYVGSRWVPYLLGNPGRKIMEFLSATEYNWDNVLSNEKLY*；突变体Y155A氨酸序列SEQ ID NO.4：MNEKFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREIAYHLAKMGAHVVVTARSKEALQKVVARCLELGAASAHYIAGSMEDMTFAEELVAEAGNLMGGLDMLILNHVLYNRLSFFHGEIDNVRKSMEVNFHSFVVLSVAAMPMLMQSQGSIAVVSSVAGKITAPLIAPYSASKFALDGFFSTLRSEFLVNKVNVSITLCILGLIDTETAAKATSGIYLGPASPKEECALEIIKGTALRQDEMYYVGSRWVPYLLGNPGRKIMEFLSATEYNWDNVLSNEKLY*；突变体I158A氨酸序列SEQ ID NO.5：MNEKFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREIAYHLAKMGAHVVVTARSKEALQKVVARCLELGAASAHYIAGSMEDMTFAEELVAEAGNLMGGLDMLILNHVLYNRLSFFHGEIDNVRKSMEVNFHSFVVLSVAAMPMLMQSQGSIAVVSSVAGKITYPLAAPYSASKFALDGFFSTLRSEFLVNKVNVSITLCILGLIDTETAIKATSGIYLGPASPKEECALEIIKGTALRQDEMYYVGSRWVPYLLGNPGRKIMEFLSATEYNWDNVLSNEKLY*；突变体I202A氨酸序列SEQ ID NO.6：MNEKFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREIAYHLAKMGAHVVVTARSKEALQKVVARCLELGAASAHYIAGSMEDMTFAEELVAE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种短链脱氢酶的突变体，其特征在于，所述突变体为短链脱氢酶的第104位的亮氨酸突变为丙氨酸的突变体L104A，或者第150位的丙氨酸突变为酪氨酸的突变体A150Y，或者第155位的酪氨酸突变为丙氨酸的突变体Y155A，或者第158位的异亮氨酸突变为丙氨酸的突变体I158A，或者第202位的异亮氨酸突变为丙氨酸的突变体I202A，或者第205位的苏氨酸突变为丙氨酸的突变体T205A；所述短链脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的突变体的编码基因，其特征在于，所述突变体L104A的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9；所述突变体A150Y的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.10；所述突变体Y155A的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.11；所述突变体I158A的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.12；所述突变体I202A的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.13；所述突变体T205A的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.14。3.一种获得如权利要求2所述的编码基因的方法，其特征在于，所述突变体的编码基因由短链脱氢酶的编码基因经特异性引物对扩增得到，其中：突变体L104A的编码基因对应的特异性引物对为L104A_F/R，核苷酸序列如下：L104A
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Ftgctgtataatcgcgcgtccttttttcatggcgaaat；L104A
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Raaaaggacgcgcgattatacagcacatgattcagaatcagc；突变体A150Y的编码基因对应的特异性引物对为A150Y_F/R，核苷酸序列如下：A150Y
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Fgtagcgtgtatggtaaaattacctatccgctgattg；A150Y
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Rattttaccatacacgctactcaccacggcaata；突变体Y155A的编码基因对应的特异性引物对为Y155A_F/R，核苷酸序列如下：Y155A
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Ftatccgctggcggccccgtatagcgcaa；Y155A
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Rtacggggccgccagcggataggtaattttaccg；突变体I158A的编码基因对应的特异性引物对为I158A_F/R，核苷酸序列如下：I158A
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Fcattaaagccgcgagcggcatttatttaggtc；I158A
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【专利技术属性】
技术研发人员：于洪巍，李东炎，夏娜娜，
申请(专利权)人：杭州馨海酶源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：