一种醇脱氢酶突变体及在生产β-苯乙醇中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种醇脱氢酶突变体及在生产β

【技术实现步骤摘要】
一种醇脱氢酶突变体及在生产
β
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苯乙醇中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及醇脱氢酶突变体及应用。

技术介绍

[0002]β
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苯乙醇(又称2
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苯乙醇)具有玫瑰花香，且香味温和、清甜，纯品为无色粘稠液体。在自然界中β
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苯乙醇存在于多种花和植物的精炼油中，因其香气宜人，被广泛应用于食品、烟草、化妆品和日化用品中，是芳香族化合物中最重要的香料品种。在焦糖、蜂蜜等食品香精、酒用香精和烟用香精的配置中也发挥作用。研究发现β
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苯乙醇能够抑制细菌蛋白质和RNA的合成，因此在医药行业被用于杀菌剂抑制细菌和真菌的生长。其酯类衍生物也是具有很高价值的香料物质。
[0003]目前β
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苯乙醇的生产方法主要采用物理提取法、生物制取法和化学合成法。物理提取法采用的原材料是花和植物的精炼油，利用萃取的方法提取β
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苯乙醇。但是大部分花或者植物中β
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苯乙醇含量极低，玫瑰花是β
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苯乙醇含量较高的植物，一般5吨玫瑰鲜花能够萃取1kgβ
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苯乙醇，同时由于玫瑰一年一花，因此提取天然β
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苯乙醇生产周期长，成本昂贵，无法进行大规模生产。生物制取法主要是利用酵母发酵产生β
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苯乙醇，多数酵母发酵会产生含有β
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苯乙醇的杂醇油，微生物细胞中存在两条可能途径即苯丙酮酸途径、艾氏途径合成β
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苯乙醇。而艾氏途径几乎很少发生，这取决于酵母培养基中的氮源。只有L
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苯丙氨酸为唯一氮源时艾氏途径才占优势。而且前体物L
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苯丙氨酸会通过肉桂酸途径降解，并且此途径无法完全抑制，因此生物发酵产生的β
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苯乙醇产量很低。因此目前市场上的β
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苯乙醇主要是通过化学合成的方法获得，化学合成β
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苯乙醇有三条路线：苯
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环氧乙烷法(利用苯和环氧乙烷催化水解获得β
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苯乙醇)、氧化苯乙烯加氢法(也称氧化苯乙烯法)、回收氧化丙烯的副产物。
[0004]随着人们生活水平的提高，市场对β
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苯乙醇的需求量逐年增加，尽管我国β
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苯乙醇产业发展很快，但总体规模小，自动化程度低，产品质量低，高档次产品比例偏小。因此，开发出高品质β
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苯乙醇生产工艺至关重要。
[0005]醇脱氢酶是生物体内重要的氧化还原催化剂，在生物体内，醇脱氢酶能够催化苯乙醛生成苯乙醇。醇脱氢酶在酶促反应过程中通常以二聚体的形式进行催化反应，每个亚基结合一个底物分子和一个辅酶分子。其空间结构由底物结合腔袋、活性位点区域和辅酶结合区域组成。在酶促反应过程中酶活性位点的构象变化直接影响着酶的催化活性。目前关于β
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苯乙醇酶催化的生产工艺尚未见报道，本专利技术在前期工作的基础上筛选到一个醇脱氢酶，该酶能够催化苯乙醛生成β
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苯乙醇，但是酶的催化效率低，因此有必要对酶进行改造优化其催化活性。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的之一在于提供一种醇脱氢酶突变体。
[0007]本专利技术的目的之二在于提供编码上述过氧化氢酶突变体的基因。
[0008]本专利技术的目的之三在于提供包含上述基因的重组质粒、表达载体。
[0009]本专利技术的目的之四在于提供转化了上述重组质粒的微生物。
[0010]本专利技术的目的之五在于提供上述醇脱氢酶突变体微生物在生成β
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苯乙醇中的应用。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案概述如下：
[0012]为了探索使用苯乙醛为底物，酶催化制备β
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苯乙醇的工业化可行性，本专利技术利用基因工程技术对来源于Bacillus mojavensis LDFZ001的醇脱氢酶(BmADH，CP063276.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.1，基因序列如SEQ ID NO.2所示)进行结构模拟，碱基突变和筛选，构建针对苯甲醛高酶活性的醇脱氢酶突变体，为实现酶催化生产β
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苯乙醇奠定基础。
[0013]醇脱氢酶突变体，所述突变体在初始型醇脱氢酶氨基酸序列的第102位天冬氨酸突变为谷氨酸，以及至少在初始型过氧化氢酶氨基酸序列的下列位置之一发生了突变：第162位缬氨酸突变为苯丙氨酸、第252位亮氨酸突变为苯丙氨酸、第264位色氨酸突变为苯丙氨酸，所述初始型醇脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0014]编码所述醇脱氢酶突变体的基因，所述突变体的核酸序列在初始型醇脱氢酶的基因序列的第306位的碱基C突变为G，以及至少在初始型过氧化氢酶基因序列的下列位置之一发生了突变：第484位的碱基G突变为T、第486位的碱基A突变为T、第754位的碱基C突变为T、第756位的碱基G突变为T、第791位的碱基G突变为T、第792位的碱基G突变为T，所述初始型醇脱氢酶的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0015]所述醇脱氢酶能够催化苯乙醛生成β
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苯乙醇。初始型醇脱氢酶的活性口袋中162位的缬氨酸(V162)、252位的亮氨酸(L252)和264位色氨酸(W264)在底物苯乙醛与酶的稳定结合中起作用，102位的天冬氨酸(D102)在稳定辅酶酰胺键中起作用。
[0016]本专利技术实验过程中采用的酶为来源于莫哈维芽孢杆菌LDFZ001的醇脱氢酶突变体。
[0017]具体的，所述酶为：
[0018]莫哈维芽孢杆菌LDFZ001醇脱氢酶的第102位由天冬氨酸突变为谷氨酸的突变体，记为BmADHmD102E；
[0019]莫哈维芽孢杆菌LDFZ001醇脱氢酶的第162位由缬氨酸突变为苯丙氨酸的突变体，记为BmADHmV162F；
[0020]莫哈维芽孢杆菌LDFZ001醇脱氢酶的第252位由亮氨酸突变为苯丙氨酸的突变体，记为BmADHmL252F；
[0021]莫哈维芽孢杆菌LDFZ001醇脱氢酶的第264位由色氨酸突变为苯丙氨酸的突变体，记为BmADHmW264F；
[0022]莫哈维芽孢杆菌LDFZ001醇脱氢酶的第102位由天冬氨酸突变为谷氨酸、第162位由缬氨酸突变为苯丙氨酸的突变体，记为BmADHm
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EF1；
[0023]莫哈维芽孢杆菌LDFZ001醇脱氢酶的第102位由天冬氨酸突变为谷氨酸、第252位由亮氨酸突变为苯丙氨酸的突变体，记为BmADHm
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EF2；
[0024]莫哈维芽孢杆菌LDFZ001醇脱氢酶的第102位由天冬氨酸突变为谷氨酸、第264位由色氨酸突变为苯丙氨酸的突变体，记为BmADHm
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EF3；
[0025]莫哈维芽孢杆菌LDFZ001醇本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体在初始型醇脱氢酶氨基酸序列的第102位天冬氨酸突变为谷氨酸，以及至少在初始型过氧化氢酶氨基酸序列的下列位置之一发生了突变：第162位缬氨酸突变为苯丙氨酸、第252位亮氨酸突变为苯丙氨酸、第264位色氨酸突变为苯丙氨酸，所述初始型醇脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1所述醇脱氢酶突变体的基因，其特征在于，所述突变体的核酸序列在初始型醇脱氢酶的基因序列的第306位的碱基C突变为G，以及至少在初始型过氧化氢酶基因序列的下列位置之一发生了突变：第484位的碱基G突变为T、第486位的碱基A突变为T、第754位的碱基C突变为T、第756位的碱基G突变为T、第791位的碱基G突变为T、第792位的碱基G突变为T，所述初始型醇脱氢酶的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.包含权利要求2所述基因的重组质粒、表达载体。4.包含权利要求3所述重组质粒的重组细胞。5.一种微生物，其通过转化权利要求3所述重组质粒得到。6.根据权利要求5所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌BL21。7.权利要求1所述的醇脱氢酶突变体或权利要求5
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6任一项所述的微生物在生成β
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苯乙醇中的应用。8.一种β
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苯乙醇生产方法，其特征在于，所述方法包括以苯乙醛为底物，以...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，冯志彬，
申请(专利权)人：山东中酶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：