一种抗破伤风单克隆抗体组合物的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物免疫学技术领域，具体地说是一种抗破伤风单克隆抗体组合物的制备方法及应用。一种抗破伤风单克隆抗体组合物，其特征在于：所述的组合物包括：4株单克隆抗体，所述的4株单克隆抗体名称分别为S3A4、9

【技术实现步骤摘要】
一种抗破伤风单克隆抗体组合物的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物免疫学
，具体地说是一种抗破伤风单克隆抗体组合物的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]破伤风是由破伤风杆菌入侵创伤而引起的一种特异性感染，其主要致病原是破伤风杆菌产生的破伤风类毒素。破伤风类毒素是一个由1315个氨基酸组成的分子量约为150kDa蛋白。该多肽在破伤风杆菌的蛋白水解酶作用后，在456和467氨基酸残基之间裂解成为分量大约为50KD轻链(LC)和100KD重链(LN)，LC和LN通过一对二硫键S439
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S467连接。LC是锌依赖蛋白酶，在193
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197位有一个锌指结合蛋白的功能域HELIH，375位的酪氨酸是一个催化活性位点。在864和863之间有一个木瓜蛋白酶(papin)切位点可以将重链进一步降解为N端(HCN)和C端(HCC或TTC)。HCN负责突触囊泡通过细胞质进入细胞质的膜，而TTC负责毒素结合神经元细胞。当TTC结合神经元上神经节苷脂受体后，在HCN协助下，LC进入神经元后被运输到神经元胞质，在那里裂解可溶性NSF黏附蛋白(solubleNSFattachmentprotein(SNAP)eceptor(SNARE)proteins)，通过水解突触囊泡蛋白Ⅱ而阻断神经抑制性介质的释放，阻断了神经元和运动神经元之间的信号传递，从而产生了破伤风特有的痉挛性瘫痪特征。表现为全身骨骼肌持续性强直和阵发性痉挛，重症患者可发生喉痉挛、窒息、肺部感染和器官功能衰竭，是一种极为严重的潜在致命性疾病。
[0003]目前对破伤风的认识是防重于治。破伤风在当下的预防措施包括注射破伤风类毒素主动免疫，正确处理伤口，以及在伤后采用被动免疫预防发病。最有效的方法是注射破伤风抗毒素(TAT)、马破伤风免疫球蛋白F(ab
’
)2或人破伤风免疫球蛋白(TIG)。破伤风抗毒素(TAT)和马破伤风免疫球蛋白均是用破伤风类毒素免疫马匹所制得的抗毒素，其形式有所差异的，这两种形式的抗毒素来源于马匹，有一定程度过敏反应，而人破伤风免疫球蛋白(TIG)是破伤风类毒素免疫人体所制得的抗毒素，虽然无过敏性但具有较昂贵、来源少、制备复杂、供应不足等等缺点。我国临床上广泛使用的仍为TAT，只有在TAT过敏试验阳性或者家属主动要求的情况下才会使用TIG。因此，人们希望找到一种低过敏性且价格低廉的抗体，可以替代目前的抗体来源。
[0004]随着杂交瘤单克隆技术和噬菌体展示技术以来，人们逐渐在该领域中使用这些技术进行研究，但是这些研究仍存在的一些问题：
①
有的文章未报到筛选到单克隆抗体或者未测序；
②
筛选到的序列未进行克隆表达，仅做了序列分析；
③
克隆表达的序列仅仅进行了体外ELLISA和(或)体外结合实验，未知体内的保护作用；
④
有的序列表达后进行了小鼠体内中和保护实验，但没有或者很弱的协同保护作用。一种常见的思路就是多种单抗混合类似“鸡尾酒”方式，这种思路方案有两种方案，一是分别表达单抗，再混合；一是混合表达单抗。

技术实现思路

[0005]本专利技术为克服现有技术的不足，提供一种抗破伤风单克隆抗体组合物的制备方法及应用，利用破伤风类毒素免疫小鼠，获得了4株具有协同保护作用的单克隆抗体，并进一步对其结合片段的定位。并进行人源化且重组表达后，其协同中和保护作用的效价可达70IU/mg。
[0006]为实现上述目的，设计一种抗破伤风单克隆抗体组合物，其特征在于：所述的组合物包括：4株单克隆抗体，所述的4株单克隆抗体名称分别为S3A4、9
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7A4、9
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8C7、S1D2，并且每株克隆抗体分别由轻链及重链组合。
[0007]所述的S3A4单克隆抗体的轻链核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，S3A4单克隆抗体的轻链核苷酸编码蛋白序列如SEQ ID NO：2所示；S3A4单克隆抗体的重链核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，S3A4单克隆抗体的重链核苷酸编码蛋白序列如SEQ ID NO：4所示。
[0008]所述的S1D2单克隆抗体的轻链核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，S1D2单克隆抗体的轻链核苷酸编码蛋白序列如SEQ ID NO：6所示；S1D2单克隆抗体的重链核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，S1D2单克隆抗体的重链核苷酸编码蛋白序列如SEQ ID NO：8所示。
[0009]所述的9
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7A4单克隆抗体的轻链核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，9
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7A4单克隆抗体的轻链核苷酸编码蛋白序列如SEQ ID NO：10所示；9
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7A4单克隆抗体的重链核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，9
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7A4单克隆抗体的重链核苷酸编码蛋白序列如SEQ ID NO：12所示。
[0010]所述的9
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8C7单克隆抗体的轻链核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，9
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8C7单克隆抗体的轻链核苷酸编码蛋白序列如SEQ ID NO：14所示；9
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8C7单克隆抗体的重链核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，9
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8C7单克隆抗体的重链核苷酸编码蛋白序列如SEQ ID NO：16所示。
[0011]一种抗破伤风单克隆抗体组合物的制备方法，具体流程如下：
[0012]S1，第一次免疫：将20ug的抗原与200ul的完全弗氏佐剂混匀，配置成400ul的溶液，注射于小鼠皮下多点；
[0013]S2，第2～5次免疫：距上次免疫间隔两周后，将20ug的抗原与200ul的不完全弗氏佐剂混匀，配置成400ul溶液，注射于Ba1b/c小鼠皮下多点；并在第4次免疫后小鼠尾静脉采血，待血清滴度>105以上；
[0014]S3，加强免疫：在小鼠尾静脉注射抗原20ug；
[0015]S4，取免疫小鼠，放血，断颈猝死，在75％的酒精中浸泡3～4min，无菌条件下取出小鼠脾脏，放入15ml的离心管中，加入少许无血清RPM 1640的培养液，用移液管轻轻吹打，碾碎，直至没有组织结块、细胞均匀为止；
[0016]S5，用无血清RPM 1640的培养液洗涤小鼠脾脏细胞三次；
[0017]S6，取对数生长期的Sp2/0
‑
Ag14的小鼠骨髓瘤细胞，在无血清RPM 1640的培养液洗涤三次；
[0018]S7，将小鼠脾脏细胞和Sp2/0
‑
Ag14的小鼠骨髓瘤细胞以10:1的比例混合，1500rpm离心7min，洗去上清液；
[0019]S8，在1min内缓缓加入1m1的PEG，轻摇90s，再在2.5min中内加入5ml的无血清RPM 1640的培养液，最后再加入5m1的无血清培液终止反应，静置5min后，1280rpm离心8min，弃本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
CO2 细胞培养箱中孵育，培养24h后，更换含有HAT (25 X) 的常规RPM 1640培养液，在370C、5% CO2细胞培养箱中继续孵育，培养14d后，稀释倍数小于100倍且其OD450大于1者被用于进一步筛选；S10，经筛选，获得4株单克隆抗体，分别命名为S3A4、9
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7A4、9
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8C7和S1D2，它们的中和效价分别为52IU/ml、53IU/ml、58IU/ml和60IU/ml；S11，用ELISA叠加法确定4株单克隆抗体的协同性；S12，从4株单克隆抗体中提取总RNA，并获得4株单克隆抗体的可变区编码序列；S13，将4株单克隆抗体中随机抽取2株单克隆抗体，对其轻链核苷酸序列和重链核苷酸序列分别进行人源化操作，获得轻链V区蛋白序列和重链V区蛋白序列；S16，将鼠kappa链的前导肽序列氨基酸序列、人的kappa链恒定区和轻链V区蛋白序列串联、优化后，获得zumb轻链的核苷酸；S17，将鼠kappa链的前导肽序列氨基酸序列、人的IgG1恒定区蛋白序列和重链V区蛋白序列串联、优化后，获得zumb重链的核苷酸；S18，将步骤S16及S17获得的zumb轻链的核苷酸和zumb重链的核苷酸进行基因合成，同时亚克隆到载体pCDNA3.1（+）中，获得单克隆抗体组合物；S19，将单克隆抗体组合物进行蛋白表达稳定株建立；S20，将蛋白表达稳定株建立后的单克隆抗体组合物进行纯化处理，最终获得安全有效量的抗破伤风单克隆抗体组合物。7.根据权利要求6所述的一种抗破伤风单克隆抗体组合物的制备方法，其特征在于：所述的抗原为宁波荣升公司的破伤风类毒素，批号为501...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱崇日，吴琼，李鑫，勾英，李丹，邵佳慧，金侠，范铁炯，
申请(专利权)人：上海赛伦生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：