一种促进胰岛α细胞转化为β细胞的诱导方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种促进胰岛α细胞转化为β细胞的诱导方法及其应用，所述诱导方法在传统诱导方法的基础上，在诱导分化第35天时，更换为胰岛α细胞转化为β细胞的培养基，同时添加蒿甲醚和GABAA激活剂NS11394诱导至第40天。经验证发现，本发明专利技术所述的诱导方法能够显著提高胰岛β细胞的表达量，适合规模化细胞制剂的生产和临床应用。生产和临床应用。生产和临床应用。

A kind of promoting islet of Langerhans \u03b1 Cells transform into \u03b2 Cell induction method and its application

【技术实现步骤摘要】
一种促进胰岛
α
细胞转化为
β
细胞的诱导方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体地，本专利技术涉及一种促进胰岛α细胞转化为β细胞的诱导方法及其应用。

技术介绍

[0002]糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗引起的以高血糖为特征的一组慢性代谢性疾病，主要分为1型糖尿病(Type 1diabetes mellitus，T1DM)、2型糖尿病(Type 2diabetes mellitus，T2DM)、妊娠糖尿病(Gestational diabetes mellitus，GDM)和单基因糖尿病。据统计，截止至2019年全球糖尿病患者超4.63亿，预计2045年将增至7亿。其中，1型糖尿病是一种由T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病。由于胰岛细胞受损而导致胰岛素分泌不足，1型糖尿病患者需要完全依赖外源胰岛素治疗。虽然胰岛素治疗已从过去的“每日餐前一针”发展到“人工智能控制的胰岛泵”，但并不能根治，也不能防止包括视网膜病变、神经病变等一系列并发症的发生。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导多能干细胞分化为功能性胰岛β细胞的诱导分化剂，其特征在于，所述诱导分化剂包括第一阶段诱导分化剂、第二阶段诱导分化剂、第三阶段诱导分化剂、第四阶段诱导分化剂、第五阶段诱导分化剂、第六阶段诱导分化剂、第七阶段诱导分化剂、第八阶段诱导分化剂；优选地，所述第一阶段诱导分化剂包括第一阶段诱导分化剂A、第一阶段诱导分化剂B；更优选地，所述第一阶段诱导分化剂A包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、GDF8、CHIR
‑
99021；更优选地，所述第一阶段诱导分化剂B包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、GDF8；优选地，所述第二阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、FGF
‑
7；优选地，所述第三阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、FGF
‑
7、SANT
‑
1、视黄酸、LDN193189、胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、TPPB；优选地，所述第四阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、FGF
‑
7、SANT
‑
1、视黄酸、LDN193189、胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、TPPB；优选地，所述第五阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、SANT
‑
1、视黄酸、LDN193189、胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5i II、硫酸锌、肝素；优选地，所述第六阶段诱导分化剂包括第六阶段诱导分化剂A、第六阶段诱导分化剂B；更优选地，所述第六阶段诱导分化剂A包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、LDN193189、胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX、肝素；更优选地，所述第六阶段诱导分化剂B包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、LDN193189、胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5i II、硫酸锌、肝素；优选地，所述第七阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5iII、硫酸锌、肝素、乙酰
‑
l
‑
半胱氨酸、水溶性维生素E、R428；优选地，所述第八阶段诱导分化剂包含蒿甲醚和NS11394；更优选地，所述第八阶段诱导分化剂还包含谷氨酰胺、二水氯化钙、N
‑
2羟乙基哌嗪
‑
N
‑2‑
乙烷磺酸、胎牛血清白蛋白、胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、水溶性维生素E、烟酰胺、肝素、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、Necrostatin
‑
1、Pefabloc；最优选地，所述第一阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(10
‑
500)ng/mL GDF8、(0.5
‑
20)μM CHIR
‑
99021、(0.01
‑
5)％胎牛血清白蛋白、(1
‑
50)mM葡萄糖、(0.05
‑
10)mM谷氨酰胺、(0.05
‑
10)g/L碳酸氢钠；最优选地，所述第一阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：100ng/mL GDF8、3μM CHIR
‑
99021、0.5％胎牛血清白蛋白、10mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠；更优选地，所述第二阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01
‑
5)mM抗坏血酸、(10
‑
100)ng/mL FGF
‑
7、(0.01
‑
5)％胎牛血清白蛋白、(1
‑
50)mM葡萄糖、(0.05
‑
10)mM谷氨酰
胺、(0.05
‑
10)g/L碳酸氢钠；最优选地，所述第二阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、50ng/mL FGF
‑
7、0.5％胎牛血清白蛋白、10mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠；更优选地，所述第三阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01
‑
5)mM抗坏血酸、(10
‑
100)ng/mL FGF
‑
7、(0.01
‑
5)μM SANT
‑
1、(0.01
‑
10)μM视黄酸、(10
‑
500)nM LDN193189、(0.01
‑
5)％胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、(50
‑
500)nM TPPB、(0.05
‑
10)％胎牛血清白蛋白、(1
‑
50)mM葡萄糖、(0.05
‑
10)mM谷氨酰胺、(0.05
‑
10)g/L碳酸氢钠；最优选地，所述第三阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、50ng/mL FGF
‑
7、0.25μM SANT
‑
1、1μM视黄酸、100nM LDN193189、0.5％胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、200nM TPPB、2％胎牛血清白蛋白、10mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、2.5g/L碳酸氢钠；更优选地，所述第四阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01
‑
5)mM抗坏血酸、(0.01
‑
10)ng/mL FGF
‑
7、(0.01
‑
5)μM SANT
‑
1、(0.01
‑
10)μM视黄酸、(10
‑
500)nM LDN193189、(0.01
‑
5)％胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、(50
‑
500)nM TPPB、(0.05
‑
10)％胎牛血清白蛋白、(1
‑
50)mM葡萄糖、(0.05
‑
10)mM谷氨酰胺、(0.05
‑
10)g/L碳酸氢钠；最优选地，所述第四阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、2ng/mL FGF
‑
7、0.25μM SANT
‑
1、1μM视黄酸、100nM LDN193189、0.5％胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、200nM TPPB、2％胎牛血清白蛋白、10mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、2.5g/L碳酸氢钠；更优选地，所述第五阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01
‑
5)μMSANT
‑
1、(0.01
‑
10)μM视黄酸、(10
‑
500)nM LDN193189、(0.01
‑
5)％胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、(0.01
‑
10)μM三碘甲状腺原氨酸、(0.01
‑
50)μM ALK5iII、(1
‑
50)μM硫酸锌、(1
‑
50)μg/mL肝素、(0.05
‑
10)g/L碳酸氢钠、(0.05
‑
10)mM谷氨酰胺、(1
‑
50)mM葡萄糖、(0.05
‑
10)％胎牛血清白蛋白；最优选地，所述第五阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25μM SANT
‑
1、0.1μM视黄酸、100nM LDN193189、0.5％胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、1μM三碘甲状腺原氨酸、10μM ALK5iII、10μM硫酸锌、10μg/mL肝素、1.5g/L碳酸氢钠、2mM谷氨酰胺、20mM葡萄糖、2％胎牛血清白蛋白；最优选地，所述第六阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(10
‑
500)nM LDN193189、(0.01
‑
5)％胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、(0.01
‑
10)μM三碘甲状腺原氨酸、(0.01
‑
50)μM ALK5iII、(1
‑
50)μM硫酸锌、(10
‑
500)nM GSiXX、(1
‑
50)μg/mL肝素、(0.05
‑
10)g/L碳酸氢钠、(0.05
‑
10)mM谷氨酰胺、(1
‑
50)mM葡萄糖、(0.05
‑
10)％胎牛血清白蛋白；最优选地，所述第六阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：100nM LDN193189、0.5％胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、1μM三碘甲状腺原氨酸、10μM ALK5i II、10μM硫酸锌、100nM GSi XX、10μg/mL肝素、1.5g/L碳酸氢钠、2mM谷氨酰胺、20mM葡萄糖、2％胎牛血清白蛋白；更优选地，所述第七阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01
‑
5)％胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、(0.01
‑
10)μM三碘甲状腺原氨酸、(0.01
‑
50)μMALK5i II、(1
‑
50)μM硫酸锌、(1
‑
50)μg/mL肝素、(0.01
‑
10)mM乙酰
‑
l
‑
半胱氨酸、(1
‑
50)μM水溶性维生素E、(1
‑
10)μM R428、(0.05
‑
10)g/L碳酸氢钠、(0.05
‑
10)mM谷氨酰胺、(1
‑
50)mM葡萄糖、(0.05
‑
10)％胎牛血清白蛋白；
最优选地，所述第七阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.5％胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、1μM三碘甲状腺原氨酸、10μM ALK5iII、10μM硫酸锌、10μg/mL肝素、1mM乙酰
‑
l
‑
半胱氨酸、10μM水溶性维生素E、2μMR428、1.5g/L碳酸氢钠、2mM谷氨酰胺、20mM葡萄糖、2％胎牛血清白蛋白；更优选地，所述第八阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01
‑
5)％胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、(1
‑
50)μM水溶性维生素E、(1
‑
50)mM烟酰胺、(1
‑
50)μg/mL肝素、(0.01
‑
10)U/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、(10
‑
500)μMNecrostatin
‑
1、(0.01
‑
5)μM Pefabloc、(0.01
‑
10)mM谷氨酰胺、(0.01
‑
10)mM二水氯化钙、(0.1
‑
50)mM N
‑
2羟乙基哌嗪
‑
N
‑2‑
乙烷磺酸、(0.05
‑
10)％胎牛血清白蛋白、(1
‑
50)μM蒿甲醚、(1
‑
50)μM NS11394；最优选地，所述第八阶段诱导分化培养剂中各成分的浓度分别为：0.5％胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、10μM水溶性维生素E、10mM烟酰胺、10μg/mL肝素、1U/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、100μM Necrostatin
‑
1、0.1μM Pefabloc、2mM谷氨酰胺、2.5mM二水氯化钙、10mM N
‑
2羟乙基哌嗪
‑
N
‑2‑
乙烷磺酸、2％胎牛血清白蛋白、10μM蒿甲醚、10μM NS11394。2.一种诱导多能干细胞分化为功能性胰岛β细胞的诱导分化培养基，其特征在于，所述诱导分化培养基包括第一阶段诱导分化培养基、第二阶段诱导分化培养基、第三阶段诱导分化培养基、第四阶段诱导分化培养基、第五阶段诱导分化培养基、第六阶段诱导分化培养基、第七阶段诱导分化培养基、第八阶段诱导分化培养基；优选地，所述第一阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1中所述的第一阶段诱导分化剂；优选地，所述第二阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1中所述的第二阶段诱导分化剂；优选地，所述第三阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1中所述的第三阶段诱导分化剂；优选地，所述第四阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1中所述的第四阶段诱导分化剂；优选地，所述第五阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1中所述的第五阶段诱导分化剂；优选地，所述第六阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1中所述的第六阶段诱导分化剂；优选地，所述第七阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1中所述的第七阶段诱导分化剂；优选地，所述第八阶段诱导分化培养基包括50％Ham
’
s F
‑
12medium、50％medium 199、权利要求1中所述的第八阶段诱导分化剂。3.一种诱导多能干细胞分化为功能性胰岛β细胞的诱导分化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)提供诱导多能干细胞并在完全培养基中进行培养；(2)第一阶段诱导分化，采用第一阶段诱导分化培养基诱导步骤(1)得到的诱导多能干细胞向定型内胚层细胞分化；(3)第二阶段诱导分化，采用第二阶段诱导分化培养基诱导定型内胚层细胞向原始肠
管细胞分化；(4)第三阶段诱导分化，采用第三阶段诱导分化培养基诱导原始肠管细胞向后前肠细胞分化；(5)第四阶段诱导分化，采用第四阶段诱导分化培养基诱导后前肠细胞向胰腺祖细胞分化；(6)第五阶段诱导分化，采用第五阶段诱导分化培养基诱导胰腺祖细胞向内分泌祖细胞分化；(7)第六阶段诱导分化，采用第六阶段诱导分化培养基诱导内分泌祖细胞向未成熟胰岛β细胞分化；(8)第七阶段诱导分化，采用第七阶段诱导分化培养基诱导未成熟胰岛β细胞向成熟胰岛β细胞分化；(9)第八阶段诱导分化，采用第八阶段诱导分化培养基进一步诱导胰岛β细胞的成熟，得到功能性胰岛β细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的完全培养基为E8完全培养基；优选地，所述E8完全培养基中含有ROCK抑制剂；更优选地，所述ROCK抑制剂包括Y
‑
27632、GSK429286A、RKI
‑
1447、Y
‑
33075dihydrochloride、Thiazovivin、K
‑
115、SLx
‑
2119、Chroman1、SAR407899和/或SR
‑
3677；最优选地，所述ROCK抑制剂为Y
‑
27632；最优选地，所述Y
‑
27632的浓度为0.001
‑
100μM；最优选地，所述Y
‑
27632的浓度为10μM；优选地，步骤(1)中所述的诱导多能干细胞的细胞密度为0.1
‑
10.0
×
105cells/cm2；更优选地，步骤(1)中所述的诱导多能干细胞的细胞密度为1.8
‑
2.2
×
105cells/cm2；优选地，步骤(1)中所述的诱导多能干细胞来源于哺乳动物；更优选地，步骤(1)中所述的诱导多能干细胞来源于人类、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、猪、猫、兔、狗、狼、马、或牛；最优选地，步骤(1)中所述的诱导多能干细胞来源于人类；优选地，步骤(2)中所述的第一阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、生长分化因子、GSK
‑
3抑制剂；更优选地，所述生长分化因子包括GDF8、GDF15、GDF9、GDF11、GDF8、GDF5、GDF1、GDF9B、GDF6；最优选地，所述生长分化因子为GDF8；更优选地，所述GSK
‑
3抑制剂包括CHIR
‑
99021、CHIR
‑
98014、AZD
‑
2858、SB
‑
216763、AT
‑
7519、TW
‑
S119、KY
‑
19382(A3051)、NP
‑
031112、SB
‑
415286、AZD
‑
1080、AR
‑
A014418、TDZD
‑
8、LY
‑
2090314；最优选地，所述GSK
‑
3抑制剂为CHIR
‑
99021；更优选地，步骤(2)中所述的第一阶段诱导分化培养基包括第一阶段诱导分化培养基A、第一阶段诱导分化培养基B；
最优选地，所述第一阶段诱导分化培养基A包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、GDF8、CHIR
‑
99021；最优选地，所述第一阶段诱导分化培养基B包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、GDF8；最优选地，所述第一阶段诱导分化的时间为3天；最优选地，在诱导第1天，采用第一阶段诱导分化培养基A进行诱导分化；最优选地，在诱导第2
‑
3天，采用第一阶段诱导分化培养基B进行诱导分化；最优选地，所述第一阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(10
‑
500)ng/mL GDF8、(0.5
‑
20)μM CHIR
‑
99021、(0.01
‑
5)％胎牛血清白蛋白、(1
‑
50)mM葡萄糖、(0.05
‑
10)mM谷氨酰胺、(0.05
‑
10)g/L碳酸氢钠；最优选地，所述第一阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：100ng/mL GDF8、3μM CHIR
‑
99021、0.5％胎牛血清白蛋白、10mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的第二阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、成纤维细胞生长因子；优选地，所述成纤维细胞生长因子包括FGF
‑
7、FGF
‑
2、FGF
‑
6、FGF
‑
10、FGF
‑
11、FGF
‑
12、FGF
‑
13、FGF
‑
14、FGF
‑
15、FGF
‑
16、FGF
‑
17、FGF
‑
18、FGF
‑
21、FGF
‑
5、FGF
‑
1、FGF
‑
3、FGF
‑
4、FGF
‑
8、FGF
‑
9、FGF
‑
19、FGF
‑
20；更优选地，所述成纤维细胞生长因子为FGF
‑
7；最优选地，所述第二阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01
‑
5)mM抗坏血酸、(10
‑
100)ng/mL FGF
‑
7、(0.01
‑
5)％胎牛血清白蛋白、(1
‑
50)mM葡萄糖、(0.05
‑
10)mM谷氨酰胺、(0.05
‑
10)g/L碳酸氢钠；最优选地，所述第二阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、50ng/mL FGF
‑
7、0.5％胎牛血清白蛋白、10mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠；最优选地，所述第二阶段诱导分化的时间为2天；最优选地，在诱导第4
‑
5天，采用所述第二阶段诱导分化培养基进行诱导分化；优选地，步骤(4)中所述的第三阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、成纤维细胞生长因子、SANT
‑
1、视黄酸、BMP抑制剂、胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
乙醇胺添加剂、蛋白激酶C活化物；更优选地，所述成纤维细胞生长因子包括FGF
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王贯乔，顾雨春，安翠平，
申请(专利权)人：呈诺再生医学科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：