一种基于CRISPR/Cas9系统的落叶松DNA-free基因编辑方法技术方案

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9系统的落叶松DNA

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas9系统的落叶松DNA
‑
free基因编辑方法


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9系统的落叶松DNA
‑
free基因编辑方法。

技术介绍

[0002]CRISPR系统作为一种新兴的基因定点编辑技术逐渐成熟并在多个植物中成功取得应用，利用此技术能够对目的基因进行靶向的敲除或敲入。CRISPR/Cas9通过RNA
‑
DNA碱基对识别DNA序列，任何含有NGG的PAM序列都可作为靶点。自该技术兴起以来，CRISPR/Cas9由于其简单、高效和通用的特性，已迅速成为基因组编辑的首选技术。但是CRISPR/Cas9系统的研究多集中在构建CRISPR/Cas9载体，再进行农杆菌介导或者物理转化。目前，基于CRISPR/Cas9的植物转化系统中需要引入外源基因和标记基因。标记基因主要是抗生素或除草剂的抗性基因。对于草本植物而言，因其生长周期短，可以通过相关标记基因剔除方法及多代自交杂交对外源基因进行清除。但是对于木本植物而言，个体生长周期长，重组质粒的转基因不仅会增加剔除外源基因的时间，而且随着时间的推移，这些外来的基因可能会分散到环境中其他生物体内，造成不可预估的基因突变后果或引起未知的过敏反应，进而产生无法估量的危害。因此，建立安全可靠、耗时短和低成本的无外源基因插入(DNA
‑
free)的转基因体系对于缓解木本植物基因转化潜在的负面影响是至关重要的。
[0003]落叶松作为北方地区最具代表性的寒湿性针叶林树种之一，其材质好，用途广，是北方林区的主要造林树种。相对于草本模式植物及粮食作物，获得突变体较为困难，因而，针对落叶松建立一种基于CRISPR系统的DNA
‑
free基因编辑方法对本领域技术人员来讲是非常重要的。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9系统的落叶松DNA
‑
free基因编辑方法，利用本专利技术提供的DNA
‑
free基因编辑方法可以实现落叶松目的基因的无外源基因污染编辑，成功获得落叶松基因编辑突变体。
[0005]本专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas9系统的落叶松DNA
‑
free基因编辑方法，包括如下步骤：
[0006]将Cas9蛋白与落叶松目的基因gRNA混合，得到落叶松RNP复合物；
[0007]将所述落叶松RNP复合物转化到落叶松中，得到落叶松基因编辑突变体。
[0008]优选的，所述落叶松目的基因包括PDS基因；
[0009]所述PDS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0010]优选的，对PDS基因进行编辑的靶点包括gRNA 1、gRNA 2、gRNA 3、gRNA 4和gRNA 5中的任意一个；
[0011]所述gRNA 1、gRNA 2、gRNA 3、gRNA4和gRNA 5的核苷酸序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。
[0012]优选的，所述gRNA 1、gRNA 2、gRNA 3、gRNA4和gRNA 5的引物分别为gRNA
‑
primer
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1、gRNA
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primer
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2、gRNA
‑
primer
‑
3、gRNA
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primer
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4和gRNA
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primer
‑
5；
[0013]所述gRNA
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primer
‑
1、gRNA
‑
primer
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2、gRNA
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primer
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3、gRNA
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primer
‑
4和gRNA
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primer
‑
5的核苷酸序列分别如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示。
[0014]优选的，所述转化方式包括基因枪介导转化法。
[0015]优选的，完成所述转化后，还包括对转化得到的组织进行体细胞胚诱导培养、成熟培养和植株再生。
[0016]优选的，所述落叶松DNA
‑
free基因编辑方法还包括PDS基因的克隆和体外验证。
[0017]优选的，用于所述体外验证的表达载体包括pAbAi或pUC19
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35S
‑
GFP；
[0018]所述PDS基因的克隆的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。
[0019]本专利技术提供了一种落叶松PDS基因，所述PDS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0020]本专利技术还提供了上述技术方案所述落叶松DNA
‑
free基因编辑方法或所述落叶松PDS基因在构建落叶松新品种中的应用。
[0021]有益效果：
[0022]本专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas9系统的落叶松DNA
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free基因编辑方法，通过确定落叶松目的基因编辑位点，设计目的靶点的gRNA，结合CRISPR/Cas9系统实现落叶松目的基因的DNA
‑
free编辑，获得落叶松基因编辑突变体，为落叶松及其他木本植物的基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术提供参考。
[0023]其次，本专利技术还提供了一种落叶松PDS基因，并将其成功应用到上述落叶松DNA
‑
free基因编辑方法中，获得落叶松PDS基因编辑突变体。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0025]图1为实施例1中PDS基因克隆电泳检测结果；
[0026]图2为实施例1中PDS基因片段的克隆序列比对结果；
[0027]图3为实施例1中为体外验证实验中pAbAi
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PDS
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E1线性化酶切电泳图谱，其中，M：DL 15000，1：pAbAi
‑
PDS
‑
E1线性化质粒；
[0028]图4
‑
1为实施例1中PDS基因编辑位点体外验证结果，其中，M：DL 5000，1～5：分别为五个靶点的切割结果，+：阳性对照，
‑
：阴性对照(空载)，gRNA(
‑
)：无gRNA对照，Cas(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas9系统的落叶松DNA
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free基因编辑方法，其特征在于，包括如下步骤：将Cas9蛋白与落叶松目的基因gRNA混合，得到落叶松RNP复合物；将所述落叶松RNP复合物转化到落叶松中，得到落叶松基因编辑突变体。2.根据权利要求1所述的落叶松DNA
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free基因编辑方法，其特征在于，所述落叶松目的基因包括PDS基因；所述PDS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。3.根据权利要求2所述的落叶松DNA
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free基因编辑方法，其特征在于，对PDS基因进行编辑的靶点包括gRNA 1、gRNA2、gRNA 3、gRNA4和gRNA 5中的任意一个；所述gRNA 1、gRNA 2、gRNA 3、gRNA4和gRNA 5的核苷酸序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。4.根据权利要求3所述的落叶松DNA
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free基因编辑方法，其特征在于，所述gRNA 1、gRNA 2、gRNA 3、gRNA 4和gRNA 5的引物分别为gRNA
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primer
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1、gRNA
‑
primer
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2、gRNA
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primer
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3、gRNA
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primer
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4和gRNA
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primer
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5；所述gRNA
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primer
‑
1、gRNA
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primer...

【专利技术属性】
技术研发人员：李成浩，马苗苗，杨静莉，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：