一种PTDSS2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种使用CRISPR/Cas9技术构建PTDSS2基因条件性敲除小鼠模型的方法，其包括：1、设计针对鼠源PTDSS2基因Exon2

【技术实现步骤摘要】
一种PTDSS2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种PTDSS2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas9技术是通过设计特异性sgRNA实现特异性的DNA识别，并且在靶向位置完成切割，再通过细胞本身的DNA修复机制，完成断裂处的修复，从而实现目标基因的“编辑”。而随着CRISPR/Cas9技术的发展和研究的深入，其被广泛应用于构建转基因的模式动物（主要为基因编辑小鼠），从而为临床前提供动物层面治疗的基础研究。
[0003]人类疾病的发病机制研究和筛选有效的治疗药物均需要进行大量临床前试验。由于直接利用人细胞及组织进行临床前相关研究受到伦理方面的限制，动物模型就成为人类生物学研究的替代选择。小鼠具有体积小、易维持与操作、繁殖周期短、与人在基因组和生理学等特征方面相似，以及已经有相应成熟的基因修饰技术等优势，因此成为广泛应用的哺乳动物模式生物系统。但由于小鼠生理特征与人存在较多差异，利用动物模型得到的实验结果有时不能适用到人体上。然而利用基因修饰或细胞与组织移植的方法，将人类基因或细胞组织“放置”在小鼠模型上所制备的人源化小鼠模型（即带有人类功能性基因、人类细胞或组织的小鼠模型），极大程度上模拟人类基因或细胞组织的相关活动，大大提高了这类小鼠模型作为模拟某些人类疾病的有效性。
[0004]PTDSS2（Phosphatidylserine Synthase 2）是一种蛋白质编码基因，该基因编码的蛋白质能够催化磷脂酰乙醇胺转化为磷脂酰丝氨酸。磷脂酰丝氨酸是一种结构膜磷脂，在细胞信号传导、凝血和凋亡中起作用，该基因的一个重要旁系同源物是PTDSS1。目前关于PTDSS2机制研究比较少，CKO小鼠模型有利于进行相应分子以及功能等方面的研究。
[0005]PTDSS2 Cas9
‑
CKO小鼠是利用基因修饰的方法，在小鼠的PTDSS2基因上的特定位点插入LoxP，将flox小鼠与表达Cre重组酶的小鼠交配，利用Cre
‑
LoxP系统获得PTDSS2基因条件性敲除小鼠，同时通过Cre诱导可以实现在特定的组织或者特定时间对PTDSS2基因的敲除。
[0006]目前暂未检索到采用CRISPR/Cas9技术构建PTDSS2基因条件性敲除小鼠的相关报道。

技术实现思路

[0007]为解决上述技术问题，本专利技术包括以下几个方面：本专利技术的第一方面提供一种PTDSS2基因条件性敲除小鼠模型构建方法，该方法包括如下步骤：（1）设计针对鼠源PTDSS2基因Exon2
‑
Exon3的sgRNA；（2）利用体外转录技术获得上述sgRNA；（3）将打靶载体、步骤（2）获得的sgRNA、Cas9蛋白共注射或共电转至小鼠受精卵细
胞质或细胞核中，并将该受精卵移植至假孕小鼠，对假孕生仔鼠进行基因型鉴定，筛选成功插入正确人源片段的阳性F0小鼠；（4）F0小鼠与背景鼠配繁获得F1小鼠，对F1代鼠尾进行基因鉴定，筛选出PTDSS2基因条件性敲除小鼠模型。
[0008]优选的，所述步骤（1）中两端sgRNA识别位点分别位于小鼠PTDSS2基因的第二个外显子之前和第三个外显子之后。
[0009]优选的，所述步骤（1）中sgRNA的基因序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中的一个或多个。
[0010]更优选的，所述步骤（1）中sgRNA的基因序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
[0011]优选的，所述步骤（2）中以sgRNA
‑
F、sgRNA
‑
R为引物对，puc57
‑
sgRNA质粒为模板进行PCR，PCR产物纯化制备sgRNA转录模板，并经过体外转录得到sgRNA。
[0012]优选的，所述步骤（2）中的引物对选自SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示序列对中一对或多对。
[0013]更优选的，所述步骤（2）中的引物对如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，以及SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
[0014]优选的，所述步骤（2）中的PCR反应体系如下：。
[0015]优选的，所述步骤（2）中的PCR反应条件如下：。
[0016]优选的，所述步骤（3）中提供受精卵的小鼠和假孕小鼠的品系为C57BL/6J。
[0017]优选的，所述步骤（3）中F0小鼠基因型鉴定使用的5
’
端鉴定引物如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，3
’
端鉴定引物如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
[0018]优选的，所述步骤（3）中F0小鼠基因型鉴定使用的PCR反应条件如下：
。
[0019]优选的，所述步骤（3）中F0小鼠基因型鉴定使用的PCR反应体系如下：。
[0020]本专利技术的第二方面提供模型构建方法得到的小鼠在研究PTDSS2基因相关功能和作用机制中的应用。
[0021]优选的，所述应用是非诊断和非治疗目的的。
[0022]本专利技术的第三方面提供上述构建方法得到的小鼠在筛选用于治疗与PTDSS2基因相关疾病的药物中的应用。
[0023]优选的，所述应用是非诊断和非治疗目的的。
[0024]本专利技术产生的有益效果：与传统ES打靶小鼠模型相比，本专利技术的PTDSS2基因条件性敲除小鼠模型具有高效、快捷、简便、成本便宜等特点，且CKO模型可以通过Cre来调控基因在特定的组织或特定时间进行表达，可以满足小鼠模型在不同研究方向的需求，同时节省了时间及成本。
附图说明
[0025]图1为本专利技术F0代小鼠PTDSS2
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CKO 5端、3端与野生型鉴定电泳图（DNA Marker条带：600bp\500bp\400bp\300bp\200bp\100bp）；图2为本专利技术F1代小鼠PTDSS2
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CKO 5端、3端与野生型鉴定电泳图（DNA Marker条带：600bp\500bp\400bp\300bp\200bp\100bp）；图3为本专利技术小鼠PTDSS2
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CKO 5端、3端与野生型鉴定电泳图中DNA Marker条带示
意图。
具体实施方式
[0026]实施例1、PTDSS2基因条件性敲除小鼠模型的构建本实施例使用CRISPR Cas9技术对小鼠PTDSS2基因进行基因修饰，基因稳定遗传的小鼠与表达Cre重组酶的小鼠交配后，flox小鼠被敲除，敲除该区域将导致蛋白质功能被破坏。如无特别说明，本实施例采用的小本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PTDSS2基因条件性敲除小鼠模型构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）设计针对鼠源PTDSS2基因Exon2
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Exon3的sgRNA；（2）利用体外转录技术获得上述sgRNA；（3）将打靶载体、步骤（2）获得的sgRNA、Cas9蛋白共注射或共电转至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，并将该受精卵移植至假孕小鼠，对假孕生仔鼠进行基因型鉴定，筛选成功插入正确人源片段的阳性F0小鼠；（4）F0小鼠与背景鼠配繁获得F1小鼠，对F1代鼠尾进行基因鉴定，筛选出PTDSS2基因条件性敲除小鼠模型。2.根据权利要求1所述的小鼠模型构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中两端sgRNA识别位点分别位于小鼠PTDSS2基因的第二个外显子之前和第三个外显子之后。3.根据权利要求1所述的小鼠模型构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中sgRNA的基因序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中的一个或多个。4.根据权利要求3所述的小鼠模型构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中sgRNA的基因序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。5.根据权利要求1所述的小鼠模型构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中以sgRNA
‑
F、sgRNA
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R为引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：李颖，王韬，王宏宇，蒋余亭，陈景曦，黎晓雯，郑桂纯，
申请(专利权)人：广东药康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：