一种基于工程大肠杆菌的MERS-CoV病毒检测系统技术方案

本发明专利技术公开了一种基于工程大肠杆菌的MERS

A mers cov virus detection system based on engineering Escherichia coli

【技术实现步骤摘要】
一种基于工程大肠杆菌的MERS
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CoV病毒检测系统


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种基于工程大肠杆菌的MERS
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CoV病毒检测系统。

技术介绍

[0002]MERS病毒是一种β属C亚群冠状病毒，全名为中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus，简称MERS
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CoV)，感染后引发中东呼吸综合征(Middle East Respiratory Syndrome，简称MERS)，据世界卫生组织统计报道该病毒致死率约为34.4％。对此的病原学检查主要包括病毒核酸检测、抗体检测以及病毒分离。病毒核酸检测可以用于早期诊断，病毒分离为实验室检测的“金标准”。
[0003]核酸检测，即提取病原体的核酸并进行反转录和qPCR检测。目前针对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS
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CoV)检测主要是采用的是qPCR(Real time quantitative PCR，实时荧光定量PCR)中的Taqman水解探针法，基本流程是，使用咽拭子、鼻拭子等方法采集样品，然后进行病毒灭活，降低感染风险，再进行RNA提取、逆转录和qPCR检测，根据检测结果判定感染情况。但这种方法对实验条件要求严格，需要有精准的实验仪器和洁净的实验环境，且所需时长平均为两小时以上。
[0004]抗体检测，即对于病原体侵入后机体产生的抗体的检测。抗体检测是有滞后性的，需要免疫细胞呈递抗原，产生抗体；抗体主要存在于体液循环系统中；一些感染力弱的病毒，譬如HPV病毒有时甚至是血液中难以检测出足够的抗体浓度的。另外抗体检测对快速变异病毒的特异性也很难定论。
[0005]除此之外，近两年来爆发的新型冠状病毒促使了基于CRISPR/Cas检测病毒的研究，该方法显然可以推广至其它病毒的检测中。目前广为人知的是CRISPR/Cas9系统，随着研究的深入，CRISPR/Cas系统越来越多样，目前在核酸检测中应用最多的系统是靶向双链DNA的CRISPR/Cas12a和靶向RNA的CRISPR/Cas13。其中，张峰等使用CRISPR/Cas13系统开发了SHERLOCK核酸检测系统，其原理是CRISPR
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Cas13a
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sgRNA与靶基因(RNA)结合，激活Cas13a的RNase活性；Doudna,J.等则基于CRISPR
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Cas12a(Cpf1)
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sgRNA与靶基因(DNA)结合，激活Cas12a的ssDNase活性，开发了DETECTR核酸检测系统。在反应体系中存在sgRNA的靶向DNA或RNA时，可以激活Cas的核酸酶活性，通过降解标记的探针，可以实现对目标核酸的检测。然而，仅使用CRISPR检测技术通常达不到临床检验的灵敏度，所以一般需要结合一些扩增技术来提高检测的灵敏度。
[0006]如上这些检测方法均对检测条件有一定要求，因此无法实现环境中病毒的实时监测。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种基于工程大肠杆菌的MERS
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CoV病毒检测系统，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术通过对大肠杆菌进行改造，使其可以识别MRES
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CoV的刺突
蛋白(Spike protein)并发出荧光信号，并对其做安全防护处理使其可以实现病毒的检测。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0009]本专利技术提供一种用于病毒检测的工程菌，该工程菌包括PmrA/PmrB双组分系统和LuxI/LuxR群体感应系统；其中，所述PmrA/PmrB双组分系统的跨膜蛋白PmrB的胞外部分替换为待测病毒识别蛋白的受体。
[0010]进一步地，跨膜蛋白PmrB的Fe(Ⅲ)敏感域替换为待测病毒识别蛋白受体的核心结构域。
[0011]进一步地，所述待测病毒识别蛋白为MERS
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CoV包膜上的Spike蛋白，所述Spike蛋白的RBD为Gln471到Asp580。
[0012]进一步地，所述待测病毒识别蛋白的受体为人类细胞二肽基肽酶4，所述人类细胞二肽基肽酶4的核心结构域位于Gly260和Asp330之间。
[0013]进一步地，该工程菌还包括转录信号放大器，所述转录信号放大器为Hrp放大器。
[0014]进一步地，所述待测病毒为MRES
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CoV，所述工程菌为大肠杆菌工程菌。
[0015]本专利技术还提供一种上述的用于病毒检测的工程菌的用途，用于MERS
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CoV检测或用于环境中MERS
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CoV的实时监测。
[0016]本专利技术还提供一种非诊断目的的MERS
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CoV检测方法，包括：在上述的工程菌菌液中加入IPTG诱导，加入待测样品，培养，检测荧光强度即可。
[0017]本专利技术公开了以下技术效果：
[0018]本专利技术专利技术可用于MERS
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CoV的检测以及环境中该病毒的实时监测。
[0019]与传统的qPCR等检测方法相比，该技术不需要严格的实验条件和精准的实验仪器，大大降低了检测成本并且提高了检测的简便性。该技术还可实现其他的多类病毒检测，本专利技术构建出一套完整的基础质粒，仅需将跨膜蛋白PmrB中胞外受体序列改为不同目标病毒受体，即可实现多病毒检测。
[0020]本专利技术的工程菌在一定安全处理条件下可较为长期的用于环境中的病毒监测，目前实验数据显示，该工程菌在实验条件中激活的状态下，可实现近10小时的监测功能，在2
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8小时的监测效果最为显著。该技术应用于生物实验室可用于检测生物病毒污染，谨防实验室生物安全问题。应用于医院、机场等人流密集的公共场所，可实时检测环境中的不同种类的病毒，可预防大型公共卫生安全事件的爆发。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1为本专利技术病毒检测系统的设计示意图；
[0023]图2为EGFP荧光强度；数值代表平均SEM；**p<0.01与对照组比较，以及***p<0.001与对照组比较；Ctrl：检测细菌；IPTG：检测菌+IPTG；IPTG+S Pr：检测菌+IPTG+S蛋白；
[0024]图3为无群体感应和有群体感应工程菌的荧光强度；
[0025]图4为检测MERS
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CoV的Spike蛋白的质粒；
[0026]图5为以pETDuet
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1和pACYCDuet
‑
1为载体构本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于病毒检测的工程菌，其特征在于，该工程菌包括PmrA/PmrB双组分系统和LuxI/LuxR群体感应系统；其中，所述PmrA/PmrB双组分系统的跨膜蛋白PmrB的胞外部分替换为待测病毒识别蛋白的受体。2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，跨膜蛋白PmrB的Fe(Ⅲ)敏感域替换为待测病毒识别蛋白受体的核心结构域。3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述待测病毒识别蛋白为MERS
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CoV包膜上的Spike蛋白，所述Spike蛋白的RBD为Gln471到Asp580。4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述待测病毒识别蛋白的受体为人类细胞二肽基肽酶4，所述人类细胞二肽基肽酶4的核心结构域位于Gly260和Asp330之间。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄永业，于阳，吴自涵，
申请(专利权)人：东北大学，
类型：发明
国别省市：