一种肿瘤干细胞获取方法技术

本发明专利技术提供了一种肿瘤干细胞获取方法，该方法将胶质瘤细胞系进行干性培养，干性培养过程中对细胞进行低温刺激等手段，以激活并扩增起始肿瘤干种子细胞，然后利用干性相关标志物进行分选，分选后培养过程中去除贴壁的无干性特征的胶质瘤细胞，剩余悬浮细胞可进行重复多次的肿瘤球培养即肿瘤干细胞。本发明专利技术所述的肿瘤干细胞获取方法可以快速扩增干性较强的细胞，为后期的分选、培养提供大量的肿瘤干种子细胞，本方法适用于大规模肿瘤干细胞库建库使用，以满足常规肿瘤生物医学基础研究、临床研究以及抗肿瘤药物开发等工作需求。究以及抗肿瘤药物开发等工作需求。究以及抗肿瘤药物开发等工作需求。

A method for obtaining tumor stem cells

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤干细胞获取方法


[0001]本专利技术属于细胞生物学领域，尤其是涉及一种肿瘤干细胞获取方法。

技术介绍

[0002]肿瘤干细胞(CSCs)是一种具有类似于体细胞干细胞能力的癌细胞亚群。CSCs在肿瘤的发生、转移、复发和耐药过程中起着关键作用。绝大部分的肿瘤被认为起源于CSCs，这可能是导致肿瘤临床治疗原发性和获得性耐药的重要原因之一，因此，近年来对于肿瘤干细胞的研究吸引了国内外肿瘤基础科研的广泛关注。
[0003]目前肿瘤干细胞主要从肿瘤组织及肿瘤细胞系中获得，由于从临床来源的肿瘤组织获得有限，且部分肿瘤组织需要进行临床病理分析，用来分离肿瘤干的大部分肿瘤组织以癌旁组织为主，这也制约着肿瘤干细胞的获取。从肿瘤细胞系获得肿瘤干细胞也存在一定局限，比如肿瘤细胞系具备干性的细胞比例低，利用磁珠或者流式细胞仪分选时会造成一定干细胞的损失，最终导致获得的肿瘤干细胞偏低或者分离失败等风险。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术旨在提出一种肿瘤干细胞获取方法，以肿瘤干细胞分选前进行干性培养，并通过低温刺激等方法，以激活并扩增起始肿瘤干种子细胞，并通过磁珠/流式分选，并在分选后培养过程中去除贴壁的无干性特征的胶质瘤细胞，以获得肿瘤干细胞，为目前肿瘤干资源匮乏提供了夯实的技术基础。
[0005]为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0006]一种肿瘤干细胞获取方法，该方法包括如下步骤：
[0007]1)胶质瘤细胞系U118MG干性培养，并在培养过程中进行低温刺激；
[0008]2)免疫磁珠分选；
[0009]3)分选后差速贴壁纯化；
[0010]4)肿瘤干快速扩增。
[0011]进一步，低温刺激的方法为：在4℃
‑
10℃的环境下培养1
‑
5次，每次10
‑
30分钟。
[0012]进一步，步骤1)具体包括如下步骤：将U
‑
118MG细胞接种在肿瘤干细胞培养基中培养3
‑
5天，肿瘤干细胞培养基为包含1
‑
40ng/ml的bFGF、1
‑
20ng/ml的EGF、0.5
‑
4％的B27
‑
50x、0.1
‑
0.4％青链霉素
‑
100x的DMEM/F12无血清完全培养基。
[0013]进一步，在进行步骤1)之前还包括U118MG细胞复苏和U
‑
118MG细胞传代。
[0014]进一步，U118MG细胞复苏包括如下步骤：从液氮罐中取出冻存的U
‑
118MG细胞，迅速置于37℃水浴锅内快速解冻，然后吸取细胞悬液到预先放置的盛有6mL预热的基础培养基的离心管中离心，弃去上清液后对细胞进行培养。
[0015]进一步，U
‑
118MG细胞传代以U
‑
118MG细胞生长密度达到培养瓶底面积的95％以上进行细胞传代，包括如下步骤：使用胰酶对培养后的细胞进行消化，消化终止使细胞复悬；对细胞悬液进行离心，弃上清，之后进行细胞培养。
[0016]进一步，步骤2)具体包括如下步骤：
[0017]1)对步骤1)得到的细胞结构进行消化处理并重悬，对细胞悬液离心，收集细胞沉淀，并再次重悬；
[0018]2)向细胞悬液中加入FcR阻断试剂、CD133磁珠，充分混匀后在冰箱中孵育；
[0019]3)对孵育后的细胞清洗、离心、重悬，之后加入分离柱中洗去未标注的细胞CD133细胞，使阳性细胞CD133
+
留在分离柱内。
[0020]进一步，在步骤3)之后、步骤4)之前还包括对肿瘤干细胞的鉴定。
[0021]进一步，肿瘤干细胞的鉴定包括如下步骤：
[0022]1)收集培养后的细胞并进行消化，向细胞中加入4％多聚甲醛固定液固定15min，之后离心并复悬；
[0023]2)分别向细胞悬液中加入FITC
‑
CD133、APC
‑
OCT4、PE
‑
CD44抗体各2μL，室温避光孵育1h；
[0024]3)PBS清洗去除未结合的CD133、OCT4、CD44抗体；
[0025]4)进行流式细胞仪检测。
[0026]相对于现有技术，本专利技术所述的肿瘤干细胞获取方法具有以下优势：
[0027]本专利技术所述的肿瘤干细胞获取方法改进肿瘤干细胞提取的方法，将胶质瘤细胞系进行干性培养，干性培养过程中对细胞进行低温刺激等手段，以激活并扩增起始肿瘤干种子细胞，然后利用干性相关标志物进行分选，分选后培养过程中去除贴壁的无干性特征的胶质瘤细胞，该类细胞表达三种干细胞特异性生物标记物(CD133
+
、OCT4
+
和CD44
+
)，并显示出多系分化的干细胞样特征，此方法能够快速扩增大量肿瘤干细胞，以满足常规肿瘤生物医学基础研究、临床研究以及抗肿瘤药物开发等工作需求。
附图说明
[0028]构成本专利技术的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：
[0029]图1为肿瘤干细胞图。
[0030]图2为肿瘤干细胞流式鉴定图；
[0031]图3为本专利技术实施例培养的肿瘤干细胞图；
[0032]图4为本专利技术对比例培养的肿瘤干细胞图。
具体实施方式
[0033]需要说明的是，在不冲突的情况下，本专利技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0034]下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。
[0035]肿瘤干细胞获取方法具体包括如下步骤：
[0036]1)U118MG细胞复苏：将癌细胞培养液及DMEM/F12基础培养基于水浴锅内预热至37℃,在15mL离心管中加入6mL预热的基础DMEM/F12培养基。从液氮罐中取出冻存的U
‑
118MG细胞，迅速置于37℃水浴锅内快速解冻(解冻程度以冻存管中剩余少量冰晶为宜)，然后吸取细胞悬液到预先放置的盛有6mL基础培养基的离心管中，室温1000r/min离心5min，弃去
上清液后加入适量培养液，细胞浓度为1
×
105细胞/mL种植于培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每2d进行一次换液处理。
[0037]2)U
‑
118MG细胞传代：U
‑
118MG细胞生长密度达到培养瓶底面积的95％以上进行细胞传代。
[0038]具体步骤：
[0039](1)提前将培养基及PBS 37℃预热。
[0040](2)吸除细胞培养液，加入少量PBS润洗细胞。
[0041](3)吸除PBS加入适量胰酶，使胰酶能够覆盖细胞，然后放入3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤干细胞获取方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：1)胶质瘤细胞系U118MG干性培养，并在培养过程中进行低温刺激；2)免疫磁珠分选；3)分选后差速贴壁纯化；4)肿瘤干快速扩增。2.根据权利要求1所述的肿瘤干细胞获取方法，其特征在于：低温刺激的方法为：在4℃
‑
10℃的环境下培养1
‑
5次，每次10
‑
30分钟。3.根据权利要求1所述的肿瘤干细胞获取方法，其特征在于：步骤1)具体包括如下步骤：将U
‑
118MG细胞接种在肿瘤干细胞培养基中培养3
‑
5天，肿瘤干细胞培养基为包含1
‑
40ng/ml的bFGF、1
‑
20ng/ml的EGF、0.5
‑
4％的B27
‑
50x、0.1
‑
0.4％青链霉素
‑
100x的DMEM/F12无血清完全培养基。4.根据权利要求1所述的肿瘤干细胞获取方法，其特征在于：在进行步骤1)之前还包括U118MG细胞复苏和U
‑
118MG细胞传代。5.根据权利要求4所述的肿瘤干细胞获取方法，其特征在于：U118MG细胞复苏包括如下步骤：从液氮罐中取出冻存的U
‑
118MG细胞，迅速置于37℃水浴锅内快速解冻，然后吸取细胞悬液到预先放置的盛有6mL预热的基础培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘庆喜，肖海蓉，赵梦莲，任倩影，
申请(专利权)人：齐鲁理工学院，
类型：发明
国别省市：