一种家蚕核型多角体病毒多角体的多量高效提取方法技术

本发明专利技术公开了一种家蚕核型多角体病毒多角体的多量高效提取方法，包括如下步骤：纱布过滤粗提、离心精提纯化、根据沉淀的不同颜色，分梯度的收集管壁内的乳白色沉淀，小勺去除及纯水冲刷等，直至收集液程乳白色，回收液重复该步骤；乳白色多角体液，6000r/min离心10min，去上清液，纯水冲刷表面的异色层，收集中间纯色的多角体，留存的底部杂质层与表面液又进行离心提纯；重复数次，直至沉淀表面及管壁、管底，无异色，加入适量纯水，浓度为1.0

A multi quantity and efficient extraction method of Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus polyhedron

【技术实现步骤摘要】
一种家蚕核型多角体病毒多角体的多量高效提取方法


[0001]本专利技术涉及病毒(BmNPV)提取
，具体为一种家蚕核型多角体病毒多角体的多量高效提取方法。

技术介绍

[0002]家蚕BmNPV(Bombyx mori L.Nuclearpolyhedrosis virus，BmNPV)是昆虫病毒史上首先发现的病毒.属于杆状病毒科；它引起的家蚕BmNPV病(俗称血液型脓病)是养蚕业三大病毒病中危害最为严重的一种。其传染性极强，在世界各国蚕区时有发生。培育对BmNPV侵染具有高度耐受性的种质资源，进而选育对BmNPV病毒具有高耐受性的家蚕品种，是控制该病对蚕业生产的危害最经济有效、安全环保的手段。
[0003]随着环境的变化及市场的需求，选育对BmNPV具有高度耐受性的家蚕品种仍然是必要的，所以需要大量的BmNPV。随着分子生物学的发展，Bm N PV不再仅仅是家蚕病害，而是渐渐应用到其它领域。目前是作为外源基因高效表达的载体之一，家蚕/Bm N PV表达系统(家蚕生物反应器)已经被认为是目前最有经济意义的个体表达系统，有基因工程产品“微型发酵罐”之称。随着Bm N PV的应用，其研究也越来越多。因此为了能利用成熟的家蚕饲养技术来大量的生产Bm N PV，寻找一条简化的而且可以大规模生产及提纯的方法成为当务之急。

技术实现思路

[0004]针对以上问题，本专利技术提供了一种家蚕核型多角体病毒多角体的多量高效提取方法。
[0005]根据本专利技术的目的，本专利技术提供一种家蚕核型多角体病毒多角体的多量高效提取方法，包括如下步骤：
[0006]S1：纱布过滤粗提
[0007]S101：将病毒感染死亡的蚕体收集到收集瓶中，放入4℃冰箱中，静置一段时间，统一进行纱布过滤；
[0008]S102：将收集瓶中的液体倒入过一号滤杯，进行过滤，过滤两次后，滤液收集在容器中，标记为1号滤液；
[0009]S103：倒完液体的收集瓶中加入少量纯水，冲洗蚕体表面，将液体继续倒入一号滤杯中进行过滤，冲洗3～4次后，将滤液倒入铺有脱脂棉、一层纱布的二号滤杯进行第二次过滤，及时更换脱脂棉和最上一层纱布，避免脱脂棉及纱布上杂质过多影响过滤效率和滤液质量，收集滤液，标记为2号滤液；
[0010]S104：快速摇晃收集瓶，将蚕体残渣倒入一号滤杯中，扎紧纱布袋，用研磨棒研磨纱布袋，挤压出液体，通过二号滤杯进行过滤，及时更换脱脂棉和最上一层纱布，收集滤液，标记为3号滤液；
[0011]S2：离心精提纯化
[0012]S201：将1号、2号、3号滤液分别6000r/min离心5min，纯水冲洗管壁及沉淀表面细菌及杂质，加入少量纯水，振荡沉淀，使其混匀，分别收集；
[0013]S202：将上述处理的2号、3号液，500r/min离心5min，上液合并收集为4号液，肉眼可见杂质、颗粒、沉淀等的收集为5号液，重复2
‑
3次；
[0014]S203：1号原液、4号、5号上清50ml或10ml 4号原液加纯水至50ml，置于50ml尖底离心管中，6000r/min离心10min，去上清，用特制小勺将表面及管底杂质舀入烧杯中回收，根据沉淀的不同颜色，分梯度的收集管壁内的乳白色沉淀，小勺去除及纯水冲刷等，直至收集液程乳白色；
[0015]S204：回收液上清50ml或摇匀下部液10ml加纯水至50ml，重复数次S203步骤，收集够多的多角体；
[0016]S205：乳白色多角体液，6000r/min离心10min，去上清液，纯水冲刷表面的异色层，收集中间纯色的多角体，留存的底部杂质层与表面液又进行离心提纯；重复数次，直至沉淀表面及管壁、管底，无异色，加入适量纯水，浓度为1.0
‑
1.5
×
109个/ml,4℃保存备用。
[0017]进一步地，S1中，用纱布袋套入烧杯中制成的简易过滤杯为一号滤杯；一号滤杯口铺上脱脂棉及一层纱布制成的简易过滤杯为二号滤杯。
[0018]进一步地，S104中，将蚕体残渣倒入一号滤杯中丝腺等不溶物不倒入。
[0019]进一步地，S203、S204和S205中，所用的50ml离心管必须是尖底的，避免圆(弧)底离心管造成沉淀断层影响分梯度收集乳白色沉淀。
[0020]进一步地，S204中多角体如果不够，5号的下部溶液重复S202、S203和S204，收集更多的BmNPV多角体。
[0021]本专利技术的有益效果是：
[0022]本专利技术方法简单易行，提取的成本低；采用分梯度纱布过滤，有效提升离心机纯化速度；离心提纯时不加入其他物质，提取的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)多角体比较纯，规避家蚕品种选育添食的其他药物影响风险；可以高效的超多量提取家蚕核型多角体病毒(BmNPV)多角体。
具体实施方式
[0023]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0024]实施例1
[0025]一种家蚕核型多角体病毒多角体的多量高效提取方法，包括如下步骤：
[0026]第一步：纱布过滤粗提
[0027]将病毒感染死亡的蚕体收集到塑料瓶中，放入4℃冰箱中，静置一段时间，统一进行纱布过滤；
[0028]将纱布袋套入烧杯中(或其他容器)，为简易过滤杯，将收集瓶中的液体倒入过一号滤杯(蚕体等尽量不倒出)，进行过滤，过滤两次后，滤液收集在塑料瓶(容器)中，标记为1号；
[0029]倒完液体的收集瓶中加入少量纯水，冲洗蚕体表面，液体倒入一号滤杯中进行过滤，冲洗3～4次后，将滤液倒入铺有脱脂棉、一层纱布的二号滤杯进行第二次过滤，及时更换脱脂棉和最上一层纱布，避免脱脂棉及纱布上杂质过多影响过滤效率和滤液质量，收集滤液，标记为2号；
[0030]快速摇晃塑料瓶(容器)，将蚕体残渣倒入一号滤杯中(丝腺等不溶物尽量不倒入)，扎紧纱布袋，用研磨棒研磨纱布袋，挤压出液体，通过二号滤杯进行过滤，及时更换脱脂棉和最上一层纱布，收集滤液，标记为3号。
[0031]第二步：离心精提纯化
[0032]1号、2号、3号液分别6000r/min离心5min，纯水冲洗管壁及沉淀表面细菌及杂质，加入少量纯水，振荡沉淀，使其混匀，分别收集；
[0033]经过1步的2号、3号液，500r/min离心5min，上液收集为4号液，肉眼可见杂质、颗粒、沉淀等的收集为5号液，重复2
‑
3次；
[0034]1号原液、4号、5号上清50ml或10ml左右4号原液加纯水至50ml，置于50ml尖底离心管中，6000r/min离心10min，去上清，用特制小勺，将表面及管底杂质舀入烧杯中回收，根据沉淀的不同颜色，分梯度的收集管壁本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种家蚕核型多角体病毒多角体的多量高效提取方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：纱布过滤粗提S101：将病毒感染死亡的蚕体收集到收集瓶中，放入4℃冰箱中，静置一段时间，统一进行纱布过滤；S102：将收集瓶中的液体倒入一号滤杯，进行过滤，过滤两次后，滤液收集在容器中，标记为1号滤液；S103：倒完液体的收集瓶中加入少量纯水，冲洗蚕体表面，将液体继续倒入一号滤杯中进行过滤，冲洗3～4次后，将滤液倒入铺有脱脂棉、一层纱布的二号滤杯进行第二次过滤，及时更换脱脂棉和最上一层纱布，避免脱脂棉及纱布上杂质过多影响过滤效率和滤液质量，收集滤液，标记为2号滤液；S104：快速摇晃收集瓶，将蚕体残渣倒入一号滤杯中，扎紧纱布袋，用研磨棒研磨纱布袋，挤压出液体，通过二号滤杯进行过滤，及时更换脱脂棉和最上一层纱布，收集滤液，标记为3号滤液；S2：离心精提纯化S201：将1号、2号、3号滤液分别6000r/min离心5min，纯水冲洗管壁及沉淀表面细菌及杂质，加入少量纯水，振荡沉淀，使其混匀，分别收集；S202：将上述处理的2号、3号液，500r/min离心5min，上液合并收集为4号液，肉眼可见杂质、颗粒、沉淀等的收集为5号液，重复2
‑
3次；S203：1号原液、4号、5号上清50ml或10ml 4号原液加纯水至50ml，置于50ml尖底离心管中，6000r/min离心10min，去上清，用特制小勺将表面及管底杂质舀入烧杯中回收，根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：范永慧，李继娅，王永生，刘敏，董占鹏，李涛，邵榆岚，刘增虎，罗顺高，廖鹏飞，李琼艳，朱红涛，陈海佺，白红英，欧秀华，邓欢，
申请(专利权)人：云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：