一种防治核桃黑斑病的复合菌剂和制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种防治核桃黑斑病的复合菌剂和制备方法及其应用，本发明专利技术所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AB191已于2020年8月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.20525，绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)PCK02已于2020年8月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.20524。本发明专利技术通过使用专用培养基对核桃黑斑病高效拮抗菌株解淀粉芽孢杆菌AB191和绿针假单胞PCK02分别发酵；在获得的菌体发酵液中，按比例依次加入羧甲基壳聚糖、硅藻土、高岭土、(NH4)2HPO4、十二烷基磺酸钠后，混合制备获得复合菌剂(菌数为2

【技术实现步骤摘要】
一种防治核桃黑斑病的复合菌剂和制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于微生物
，具体是一种防治核桃黑斑病的复合菌剂，并涉及一种防治核桃黑斑病的复合菌剂的制备及其在防治核桃黑斑病中的应用。

技术介绍

[0002]核桃黑斑病是世界各地核桃主产区主要的病害之一，随着核桃产业的扩大发展，该病的发病率逐年增高，植株受害率达40
‑
70％以上，受害部位包括雌花序、叶片、嫩梢和果实，可造成核桃的产量和品质的降低。细菌性核桃黑斑病可由多种病原菌造成，除普遍已知的树生黄单胞菌核桃致病变种Xanthomonas arboricola pv.juglandis外，野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris pv.campestris和成团泛菌 Pantoea agglomerans均能引起核桃黑斑病的发生。
[0003]目前，对于核桃黑斑病的防治以化学农药为主，但化学农药对水体、土壤等环境污染严重，毒性残留并进入生物链，以及容易造成病原菌耐药。随着人们对于生态环境保护和可持续发展意识的加强，生物农药因具有安全无毒、环境友好、可持续作用等优点受到人们重视，以高效拮抗菌株为基础的生物防治展现出巨大应用潜力。
[0004]本专利技术所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AB191于 2020年8月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.20525；解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，革兰氏阳性细菌，可产生芽孢，生长繁殖速度快，抗逆性强，易存活，与植物之间的亲和性很高，在自然界中广泛分布，且制剂的生产工艺相对简单，具有开发微生物农药和肥料菌种前景。
[0005]本专利技术所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)PCK02 于2020年8月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.20524。绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)，革兰氏阴性细菌，分布范围广，有较强的生态环境适应能力，是公认的环境友好型能促进植株生长的细菌，且其菌株产生的代谢产物可对植物形成保护作用，生防潜力与应用前景广阔。

技术实现思路

[0006]针对野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris pv.campestris或成团泛菌Pantoea agglomerans引起核桃黑斑病专性微生物复合菌剂，本专利技术的目的是提供一种防治核桃黑斑病的复合菌剂和制备方法及其应用。
[0007]本专利技术所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AB191 和绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)PCK02对核桃黑斑病病菌(野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris pv.campestris和成团泛菌Pantoea agglomerans)均具有显著抑制作用。
[0008]本专利技术的目的可通过以下技术方案来实现：
[0009]本专利技术提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AB191 分离自陕西省渭南市核桃种植园核桃根际土壤，已于2020年8月12 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.20525。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)AB191具有以下生物学特性：在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈乳白色，不透明，边缘平整，表面突起，易挑起；显微镜检，菌体细胞呈杆状，产芽孢，革兰氏染色阳性。绿针假单胞菌 (Pseudomonas chlororaphis)PCK02分离自陕西省宝鸡市太白山国家森林公园，已于2020年8月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.20524。绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)PCK02具有以下生物学特征：在 KMB培养基上菌落呈橙色，圆形，表面突起，光滑，易挑起，较粘稠；显微镜检，菌体细胞呈杆状，无芽孢，革兰氏染色阴性。
[0010]本专利技术也提供了上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)AB191和绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis) PCK02的复合菌剂的制备及其在核桃黑斑病防治中的应用。
[0011]本专利技术所述复合生防菌剂的制备方法包括以下步骤：
[0012](1)活化菌株：将保存于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上的解淀粉芽孢杆菌AB191划线于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，绿针假单胞菌 PCK02划线于KMB培养基上，28℃倒置培养1
‑
2d；
[0013](2)制备种子液：挑取步骤(1)培养基平板上的单菌落分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基和KMB液体培养基中，28℃摇床振荡 24h得到种子液；
[0014](3)发酵培养：将液体发酵培养基A灭菌，步骤(2)所得解淀粉芽孢杆菌AB191的种子液按5％
‑
8％体积比接入发酵培养基A，发酵罐设置恒温30
±
1℃，搅拌速度180
‑
220rpm，发酵48
‑
72h，通过血球计数板进行活菌计数，菌数达到2.0
×
10
11
个/mL以上时终止发酵；
[0015]将液体发酵培养基B灭菌，步骤(2)所得绿针假单胞菌PCK02 的种子液按8％
‑
10％体积比接入发酵培养基B，发酵罐设置恒温 32
±
1℃，搅拌速度220
‑
250rpm，发酵48
‑
60h，通过血球计数板进行活菌计数，菌数达到1.0
×
10
11
个/mL以上时终止发酵；
[0016]优选的，所述步骤(3)中发酵培养基A(g/L)：葡萄糖10
‑
15，柠檬酸钠5
‑
10，Na2HPO
4 1.5
‑
2.0，(NH4)2SO
4 3.5
‑
4.0，MgSO
4 0.3
‑
0.5，酵母浸粉0.05
‑
0.1，CaCl2·
2H2O 0.05
‑
0.1，橙皮精油0.5
‑
1.0，调节pH7.0
‑
7.2。
[0017]优选的，所述步骤(3)中发酵培养基B(g/L)：甘油15
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.本发明的解淀粉芽孢杆菌和绿针假单胞菌其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AB191于2020年8月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.20525；绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)PCK02于2020年8月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.20524。2.本发明所述复合生防菌剂的制备方法包括以下步骤：步骤(1)活化菌株：将保存于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上的解淀粉芽孢杆菌AB191划线于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，绿针假单胞菌PCK02划线于KMB培养基上，28℃倒置培养1
‑
2d；(2)制备种子液：挑取步骤(1)培养基平板上的单菌落分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基和KMB液体培养基中，28℃摇床振荡24h得到种子液；(3)发酵培养：将液体发酵培养基A灭菌，步骤(2)所得解淀粉芽孢杆菌AB191的种子液按5％
‑
8％体积比接入发酵培养基A，发酵罐设置恒温30
±
1℃，搅拌速度180
‑
220rpm，发酵48
‑
72h，通过血球计数板进行活菌计数，菌数达到2.0
×
10
11
个/mL以上时终止发酵；将液体发酵培养基B灭菌，步骤(2)所得绿针假单胞菌PCK02的种子液按8％
‑
10％体积比接入发酵培养基B，发酵罐设置恒温32
±
1℃，搅拌速度220
‑
250rpm，发酵48
‑
60h，通过血球计数板进行活菌计数，菌数达到1.0
×
10
11
个/mL以上时终止发酵；(4)菌剂制备：将步骤(3)发酵所得两种菌液按质量比例1:1混合得到混合菌液，按照混合菌液的质量比例0.1
‑
0.8％加入羧甲基壳聚糖，之后再分别与硅藻土、高岭土以1:(4.0
‑
4.5):(5.5
‑
6.0)的质量比混合均匀，形成复合菌体
‑
硅藻土
‑
高岭土混合物；再将按质量比例(％)0.01
...

【专利技术属性】
技术研发人员：瞿佳，孙晓宇，赵玲侠，门欣，陈锐，宁硕瀛，
申请(专利权)人：陕西省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：