【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于疫苗开发，具体涉及一种基于羊肚菌和乳酸菌菌株的口服型新冠候选疫苗的制备方法及应用。
技术介绍
1、目前全球已有数十种新冠疫苗获批上市，并已被广泛接种，包括亚单位疫苗、mrna疫苗、dna疫苗、病毒载体疫苗等；但是，目前已上市的新冠疫苗多为肌肉注射疫苗。肌肉注射疫苗主要激活的是体液免疫，对黏膜免疫的诱导效果有限，所以无法在病毒感染早期阻止病原体的入侵。与注射接种相比,口服型疫苗具有使用简便、接种者接受度更高，对专业医务人员的需求不高等优点，是快速和广泛接种疫苗的理想选择。
2、目前，全世界处于研发中的口服型疫苗约10个左右，主要是通过基因工程的手段将新冠病毒的蛋白抗原展示在病毒、益生菌、酵母等载体的表面来发挥其诱导粘膜免疫的作用的，但以上方法需要对作为载体的宿主菌(载体菌)进行遗传修饰，不符合安全性疫苗的要求；同时，以上方法还具有以下的劣势：(1)不能同时展示多种抗原；(2)抗原的展示效率受限于载体菌(或病毒)的表达能力。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的主要目的在于提供一种基于羊肚菌和乳酸菌菌株的口服型新冠候选疫苗的制备方法及应用。
2、为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
3、本专利技术实施例提供一种基于羊肚菌和乳酸菌菌株的口服型新冠候选疫苗的制备方法，该制备方法通过以下步骤实现：
4、步骤1，羊肚菌工程菌株的构建：构建能够异源表达新型冠状病毒(2019novelcoronavirus，2019-
5、步骤2，羊肚菌工程菌株总蛋白提取：将所述羊肚菌工程菌株接种于pda液体培养基中，在适宜条件下发酵后，收集菌丝，通过全自动液氮冷冻研磨机研磨菌丝，研磨完成后，将研磨粉重新置于binding buffer溶液中，离心取上清液；
6、步骤3，结合反应：将所述上清液与提前制备的乳酸菌混合，在恒温震荡培养器中恒温孵育后，离心去上清，取沉淀物；
7、步骤4，口服型新冠候选疫苗成品的制备：将所述沉淀物冷冻干燥后，加入稀释剂，混匀后，装填至肠溶性胶囊壳中制得胶囊，即为口服型新冠候选疫苗成品。
8、上述方案，所述步骤1具体为：
9、(1)表达载体构建：以pcambia1391xa质粒作为质粒骨架，将s1-lcsb融合蛋白基因序列的开放阅读框置于梯棱羊肚菌(morchella importuna)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(pgpd)下，将β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)和潮霉素抗性基因(hyg)的开放阅读框都置于梯棱羊肚菌(m.importuna)的多聚泛素启动子(pubi)下，构建获得表达载体p1391xm；
10、(2)通过脓杆菌介导的转化方法将所述表达载体p1391xm转化到羊肚菌菌株sw06中，构建获得羊肚菌工程菌株sw08。
11、上述方案，所述步骤2中，所述羊肚菌工程菌株的发酵条件为：温度20～23℃，摇床震荡频率150～200rpm，发酵时间60～84小时。
12、上述方案，所述步骤2中，所述菌丝研磨的震荡频率为40～60赫兹，每次研磨时间为9～15秒，研磨次数为3次。
13、上述方案，所述步骤2中，所述bindingbuffer溶液由20mmol/l的磷酸盐缓冲液、500mmol/l的nacl、25mmol/l的咪唑组成，ph为7.4。
14、上述方案，所述步骤2中，所述离心条件为：6000～9000rpm，1～3分钟。
15、上述方案，所述步骤3中，所述乳酸菌为卷曲乳杆菌(lb.crispatus)，菌体浓度为od600＝1,所述乳酸菌与上清液的体积比为1：1。
16、上述方案，所述步骤3中，所述孵育条件为37℃，30～60分钟，所述离心条件为：12000～15000rpm，1～3分钟。
17、上述方案，所述步骤4中，所述冻干粉与稀释剂的质量比为1：2，所述稀释剂采用低聚果糖、羊肚菌多糖及淀粉的混合物，其中，低聚果糖、羊肚菌多糖及淀粉的质量比为1：1：2。
18、根据上述方案任一项所述的制备方法制备的口服型新冠候选疫苗，用于刺激宿主产生新冠病毒s1蛋白抗原的iga和igg抗体。
19、与现有技术相比，本专利技术通过卷曲乳酸杆菌s层蛋白细胞壁结合结构域成功地将羊肚菌异源表达的新型冠状病毒刺突蛋白s1亚基展示在了卷曲乳酸杆菌的细胞壁表面，制备的口服疫苗不仅具有口服疫苗的各种优势，同时与其它方法制备的口服疫苗相比能够同时展示多种抗原蛋白；避免了对载体菌的遗传修饰，安全性更高；展示能力高，且不受限于乳酸菌的表达效率。
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1.一种基于羊肚菌和乳酸菌菌株的口服型新冠候选疫苗的制备方法，其特征在于，该制备方法通过以下步骤实现：
2.根据权利要求1所述的口服型新冠候选疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体为：
3.根据权利要求1或2所述的口服型新冠候选疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述羊肚菌工程菌株的发酵条件为：温度20～23℃，摇床震荡频率150～200rpm，发酵时间60～84小时。
4.根据权利要求3所述的口服型新冠候选疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述菌丝研磨的震荡频率为40～60赫兹，每次研磨时间为9～15秒，研磨次数为3次。
5.根据权利要求4所述的口服型新冠候选疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述BindingBuffer溶液由20mmol/L的磷酸盐缓冲液、500mmol/L的NaCl、25mmol/L的咪唑组成，pH为7.4。
6.根据权利要求5所述的口服型新冠候选疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述离心条件为：6000～9000rpm，1～3分钟。
7.根据权利要求
8.根据权利要求7所述的口服型新冠候选疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，所述孵育条件为37℃，30～60分钟，所述离心条件为：12000～15000rpm，1～3分钟。
9.根据权利要求8所述的口服型新冠候选疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，所述冻干粉与稀释剂的质量比为1：2，所述稀释剂采用低聚果糖、羊肚菌多糖及淀粉的混合物，其中，低聚果糖、羊肚菌多糖及淀粉的质量比为1：1：2。
10.根据权利要求1至10任一项所述的制备方法制备的口服型新冠候选疫苗，用于刺激宿主产生新冠病毒S1蛋白抗原的IgA和IgG抗体。
...【技术特征摘要】
1.一种基于羊肚菌和乳酸菌菌株的口服型新冠候选疫苗的制备方法，其特征在于，该制备方法通过以下步骤实现：
2.根据权利要求1所述的口服型新冠候选疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体为：
3.根据权利要求1或2所述的口服型新冠候选疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述羊肚菌工程菌株的发酵条件为：温度20～23℃，摇床震荡频率150～200rpm，发酵时间60～84小时。
4.根据权利要求3所述的口服型新冠候选疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述菌丝研磨的震荡频率为40～60赫兹，每次研磨时间为9～15秒，研磨次数为3次。
5.根据权利要求4所述的口服型新冠候选疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述bindingbuffer溶液由20mmol/l的磷酸盐缓冲液、500mmol/l的nacl、25mmol/l的咪唑组成，ph为7.4。
6.根据权利要求5所述的口服型新冠候选疫...
【专利技术属性】
技术研发人员：霍文严，李峻志，贺雪莲，祁鹏，戴璐，张黎光，路鹏鹏，刘愚，乔婷，李安利，
申请(专利权)人：陕西省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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