百合病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了百合病毒的多重RT

【技术实现步骤摘要】
百合病毒的多重RT
‑
PCR检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及百合病毒检测
，具体涉及一种百合病毒的多重RT
‑
PCR 检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]百合不仅因为体态优美，花朵颜色艳丽，寓意美好，而且在食用和药用等方面都具有较高价值，是国际上重要的观赏花卉之一。我国栽培的百合种球主要依赖于进口，长期的无性繁殖导致百合种球带毒严重。目前，已报道的百合上常见病毒病有黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、车前草花叶病毒(Plantagoasiatica mosaic virus，PlAMV)、百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)、百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)，它们常表现为复合侵染，造成植株的茎、叶或花出现斑驳或畸形，严重的导致植株矮小甚至死亡，随着病毒的传播，导致百合大面积感病，严重影响了百合切花的产量和质量。
[0003]指示植物法、电镜检测法、血清学方法和分子生物学技术是国内常用的病毒检测方法，分子生物学技术包括双链RNA电泳、核酸斑点杂交(NASH)和PCR 技术。相比较来说，指示植物法虽然简单，但是检测周期长，灵敏度低。电镜检测在百合病毒的检测中也有较广泛的应用，但是电镜检测对样品要求较高，所需样品量多，而且使用的仪器昂贵，检测技术难以掌握，不适合作为常用的检测方法。分子生物学技术中RT
‑
PCR方法用于百合病毒检测在便捷性、灵敏度、特异性等方面均优于上述几种方法。
[0004]近年来在云南各地田间调查发现，百合在整个生长期，病毒病发生危害普遍且严重影响了经济发展，经系统检测鉴定，这一时期主要病原为黄瓜花叶病毒、车前草花叶病毒、百合无症病毒、百合斑驳病毒，但对组培苗、田间植株难以通过症状区分，因此无法制定有效的病害预防措施。在研究病害侵染循环和病害发生早期，利用血清学检测方法检测时，其检测灵敏度不能较好地确定不同病毒的侵染情况，因此，需要建立一种可以大量、快速、准确、灵敏的检测方法对不同时期病样以及田间周边环境中病毒传播介体、中间寄主等进行检测。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的问题，本专利技术的目的在于提供用于同时检测多种百合病毒的检测试剂盒和检测方法，可以实现多达九种百合病毒的同时检测，为百合病毒病的有效防治提供技术支持。
[0006]本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]一种百合病毒的多重RT
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PCR检测试剂盒，包括以下九对引物中的至少两对：
[0008]用于扩增CMV的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:1～2所示；
[0009]用于扩增LSV的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:3～4所示；
[0010]用于扩增LMoV的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:5～6所示；
[0011]用于扩增PlAMV的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:7～8所示；
[0012]用于扩增LAV
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1的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:9～10所示；
[0013]用于扩增LRoV
‑
1的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:11～12所示；
[0014]用于扩增LCaV
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1的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:13～14所示；
[0015]用于扩增LCaV
‑
2的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:15～16所示；
[0016]用于扩增LCrV
‑
1的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:17～18所示。
[0017]可以理解的是，该检测试剂盒可以包括9对引物中的任意4个、5个、6个、 7个或8个引物对，也可以包含全部的9对引物，且引物对可以独立包装也可以按比例混装。
[0018]优选地，由于LCrV
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1、LAV
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1、LRoV
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1、LCaV
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1、LCaV
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2为本专利技术首次发现的能侵染百合的病毒新成员，故上述多重RT
‑
PCR检测试剂盒包括用于扩增LCrV
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1、LAV
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1、LRoV
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1、LCaV
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1或LCaV
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2的引物对中的至少一个。
[0019]优选地，在上述多重RT
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PCR检测试剂盒中，九对引物的最佳摩尔比为：CMV∶ LSV∶LMoV∶PlAMV∶LAV
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1∶LRoV
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1∶LCaV
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1∶LCaV
‑
2∶LCrV
‑
1＝7∶4∶6∶ 4∶5∶6∶5∶4∶5。可以理解的是，若是试剂盒中只包含该9对引物中的部分引物对，不影响相应各引物间的最佳比例关系。
[0020]本专利技术还提供了使用上述检测试剂盒进行百合病毒的多重RT
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PCR检测方法，包括以下步骤：
[0021]S1、提取百合样品的总RNA；
[0022]S2、取总RNA通过逆转录酶合成cDNA；
[0023]S3、使用上述检测试剂盒中的引物对步骤S2所得样品进行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
[0024]当出现210bp大小的条带时，说明百合样品中含有CMV；当出现330bp大小的条带时，说明百合样品中含有LCaV
‑
2；当出现418bp大小的条带时，说明百合样品中含有LSV；当出现496bp大小的条带时，说明百合样品中含有PlAMV；当出现588bp大小的条带时，说明百合样品中含有LMoV；当出现656bp大小的条带时，说明百合样品中含有LAV
‑
1；当出现710bp大小的条带时，说明百合样品中含有LCaV
‑
1；当出现814bp大小的条带时，说明百合样品中含有LRoV
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1；当出现884bp大小的条带时，说明百合样品中含有LCrV
‑
1。
[0025]优选地，步骤S1具体为：将百合叶片研磨后与Trizol混匀，离心取上清，加入氯仿抽提；离心取上清，加入异丙醇混匀，沉降后离心弃上清；采用乙醇洗涤沉淀，再在沉淀中加入DEPC水使沉淀溶解，即为样品总RNA。
[0026]优选地，步骤S2具体为：取步骤S1制备的总RNA，加入随机引物pd(N)6 和DEPC水，先沸水浴再迅速冷却后，加入反转录混合液，吸打混匀、瞬离；37℃水浴1～1.5h后，先沸水浴再迅速冷却，瞬离即得。
[0027]更加优选地，所述反转录混合液包括：4μL5
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M
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MLV反应缓冲液、1μL2.5mMdNTPs本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种百合病毒的多重RT
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PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下九对引物中的至少四对：用于扩增CMV的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:1～2所示；用于扩增LSV的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:3～4所示；用于扩增LMoV的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:5～6所示；用于扩增PlAMV的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:7～8所示；用于扩增LAV
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1的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:9～10所示；用于扩增LRoV
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1的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:11～12所示；用于扩增LCaV
‑
1的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:13～14所示；用于扩增LCaV
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2的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:15～16所示；用于扩增LCrV
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1的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:17～18所示。2.根据权利要求1所述百合病毒的多重RT
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PCR检测试剂盒，其特征在于，所述九对引物的摩尔比为：CMV∶LSV∶LMoV∶PlAMV∶LAV
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1∶LRoV
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1∶LCaV
‑
1∶LCaV
‑
2∶LCrV
‑
1＝7∶4∶6∶4∶5∶6∶5∶4∶5。3.一种检测百合病毒的多重RT
‑
PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、提取百合样品的总RNA；S2、取总RNA通过逆转录酶合成cDNA；S3、使用权利要求1所述检测试剂盒中的引物对步骤S2所得样品进行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；当出现210bp大小的条带时，说明百合样品中含有CMV；当出现330bp大小的条带时，说明百合样品中含有LCaV
‑
2；当出现418bp大小的条带时，说明百合样品中含有LSV；当出现496bp大小的条带时，说明百合样品中含有PlAMV；当出现588bp大小的条带时，说明百合样品中含有LMoV；当出现656bp大小的条带时，说明百合样品中含有LAV
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1；当出现710bp大小的条带时，...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁芳，霍妍妍，李晓婷，洪霓，王国平，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：