一种百合病毒LCrV-1特异性检测靶序列、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种百合病毒LCrV1特异检测靶序列、试剂盒及检测方法，所述靶序列的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，所述检测试剂盒包括碱基序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对，所述检测方法为：将待测样品用改进的Trizol法对RNA进行提取，逆转录得到cDNA，使用引物对进行PCR扩增后采用凝胶电泳分析。本发明专利技术能够实现百合病毒LCrV1的快速、特异性检测，能够广泛用于田间采集的百合样品检测。能够广泛用于田间采集的百合样品检测。能够广泛用于田间采集的百合样品检测。

【技术实现步骤摘要】
一种百合病毒LCrV
‑
1特异性检测靶序列、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种百合病毒LCrV
‑
1特异检测靶序列、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]百合鳞茎色泽洁白，肉质肥厚，不仅是高蛋白低脂肪的营养保健食品，还具有止咳润肺的药用功能。近年来培育出的百合品种逐渐增多，但是百合病毒是其生产中的重要限制因子。已报道的百合病毒大部分是通过指示植物法、电镜观察法和血清学技术等鉴定出来的，但通常受限于费时、病毒粒子提取困难等很难高效、全面的发现潜在的病毒或新病毒。高通量技术(Hight
‑
throughput sequencing， HTS)可同时对几十万到几百万个DNA分子进行序列鉴定，使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，HTS被广泛应用于新病毒的发现、已知病原鉴定及基因组遗传多样性和进化的分析与比较。
[0003]国际病毒分类委员会对双分病毒科(Partitiviridae)划分为5个属，分别为甲型双分病毒属(Alphapartitivirus)、乙型双分病毒属(Betapartitivinus)、丙型双分病毒属(Gammapartitivirus)、丁型双分病毒属(Deltapartitivirus)和隐孢子虫病毒属(Cryspovirus)。其中，丁型双分病毒属(Deltapartitivirus)有五种病毒， Beet cryptic virus 2、Beet cryptic virus 3、Fig cryptic virus、Pepper cryptic virus 1 和Pepper cryptic virus 2。
[0004]本专利技术通过高通量测序从百合上鉴定到了一种新病毒Lily cryptic virus 1 (LCrV1)，通过系统进化分析和多重比对，故确认该病毒是双分病毒科丁型双分病毒属的新成员。目前已经报道的植物双分体病毒科的病毒的病毒粒子尚未获得，这些病毒主要由种子传播，不能通过机械摩擦的方式传播，但LCrV1的传播途径还需进一步明确。而且带毒种球传播难以通过组织培养方法获得无毒种球，加大了防治难度。故建立成熟的检测技术，用于市场上百合样品病毒检出率的调查，并为后续致病机理和基因功能提供技术支持，是当前迫切的需求。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于实现该百合新病毒LCrV1的快速、特异以及低含量的检测。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]本专利技术第一方面提供了一个适合百合病毒LCrV1特异性检测的靶序列，该靶序列的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]本专利技术第二方面提供了一个针对上述靶序列的百合病毒LCrV1特异性检测试剂盒，该试剂盒中包括碱基序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对。
[0009]本专利技术第三方面提供了一种百合病毒LCrV1的检测方法，具体包括以下步骤：
[0010]S1、提取百合样品的总RNA；
[0011]S2、取总RNA通过逆转录酶合成cDNA；
[0012]S3、以cDNA为模板，使用上述引物对进行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0013]优选地，步骤S1具体为：将百合叶片研磨后与Trizol混匀，离心取上清，加入氯仿抽提；离心取上清，加入异丙醇混匀，沉降后离心弃上清；采用乙醇洗涤沉淀，再在沉淀中加入DEPC水使沉淀溶解，即为样品总RNA。
[0014]优选地，步骤S2具体为：取步骤S1制备的总RNA，加入随机引物pd(N)6 和DEPC水，先沸水浴再迅速冷却后，加入反转录混合液，吸打混匀、瞬离；37℃水浴1～1.5h后，先沸水浴再迅速冷却，瞬离即得。
[0015]更加优选地，所述反转录混合液包括：4μL5
×
M
‑
MLV反应缓冲液、1μL2.5mMdNTPs、0.5μL40U/μL RNA酶抑制剂、0.5μL200U/μL M
‑
MLV和4μLDEPC水，按总体积10μL计。
[0016]优选地，步骤S3所述PCR扩增的体系为：共20μL，10.0μL 2
×
Taq Master Mix， 0.3μM引物对，1.0μL cDNA，ddH2O余量。
[0017]优选地，步骤S3所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s， 52℃退火，72℃延伸25s，30个循环；72℃完全延伸10min。
[0018]优选地，所述产物在1.2％琼脂糖凝胶电泳上进行电泳检测，其中阳性样品能扩增出大小约800bp的目的片段。
[0019]本专利技术的有益效果为：通过对百合新病毒LCrV1的序列分析，筛选得到能够用于病毒检测的特异性靶序列；根据靶序列设计特异性引物，实现了对LCrV1 病毒的快速、准确的检测，且检测灵敏度高，为LCrV1病毒的深入研究提供了支持。相较于ELISA检测、电镜检测等方法，本专利技术提供的检测方法更为简便快速，并且不需要昂贵仪器和试剂，大大节约了检测经费。
附图说明
[0020]图1为百合病毒LCrV
‑
1与Partitiviridae部分代表株系多重序列比对分析图；
[0021]图2为百合病毒LCrV
‑
1的系统发育树分析图；
[0022]图3为实施例1中凝胶电泳检测结果。
具体实施方式
[0023]下面将结合本专利技术中的实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。
[0024]本专利技术通过对百合叶片样品高通量测序，编号YN1：采自云南省昆明市的4 株百合(编号KKD3、KEKW3、HJJ3、ZBY3)的叶片混合样品，这4株植株均有叶片卷曲畸形、花叶坏死等疑似病毒病症状。所有样品经过液氮快速冷冻后送至上海派森诺公司进行高通量测序。数据分析后，将clean reads经拼接得到的contig逐一在NCBI数据库进行BlastX和BlastN比对，从上述样品中鉴定到尚未报道的能侵染百合的病毒为Lily cryptic virus 1(LCrV1)。
[0025]LCrV1包含双分病毒科病毒的8个保守的motifs I
‑
VIII(如图2所示)，即 motif I(SSAAGYGY)、II(PDVGLTRTQL)、III(TKVRNVF)、IV(DWSAFDASVQ)、 V(GIPSGSCYYTNLIGSIINYTRI)、VI(VQGDDSLT)、VII(TFLGR)和 VIII(LRLICFPEYK)。
[0026]将LCrV
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1与双分病毒科中五个病毒属成员的基因组进行比较，发现LCrV
‑
1 与丁
型双分病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种百合病毒LCrV1特异性检测靶序列，其特征在于，所述靶序列的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种针对权利要求1所述靶序列的百合病毒LCrV1特异性检测试剂盒，其特征在于，包括碱基序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对。3.一种百合病毒LCrV1的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、提取百合样品的总RNA；S2、取总RNA通过逆转录酶合成cDNA；S3、以cDNA为模板，使用权利要求2所述引物对进行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。4.根据权利要求3所述百合病毒LCrV1的检测方法，其特征在于，步骤S1具体为：将百合叶片研磨后与Trizol混匀，离心取上清，加入氯仿抽提；离心取上清，加入异丙醇混匀，沉降后离心弃上清；采用乙醇洗涤沉淀，再在沉淀中加入DEPC水使沉淀溶解，即为样品总RNA。5.根据权利要求3所述百合病毒LCrV1的检测方法，其特征在于，步骤S2具体为：取步骤S1制备的总RNA，加入随机引物pd(N)6和DEPC水，先沸水浴再迅速冷却后，加入反转录混合液，吸打混匀、瞬离；37℃水浴1～1.5h后，先沸水浴...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁芳，霍妍妍，李晓婷，洪霓，王国平，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：