一种检测肠道病毒71型的引物和探针组合及其试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种检测肠道病毒71型的引物和探针组合及其试剂盒，所述检测肠道病毒71型的引物和探针组合包括根据筛选出的高度保守序列设计的EV71上游引物，EV71下游引物，及EV71探针，所述探针的核苷酸序列如SEQID NO：3所示。本发明专利技术中，通过基于肠道病毒71型高度保守序列筛选出的引物与探针组合，和可能存在同源性序列、其他肠道病毒、其他病原体等无交叉反应，具有很好的特异性；同时，通过包含其的引物和探针组合的试剂盒检测肠道病毒71型，检测操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽，可以在较短的时间内对粪便等未知样本中的EV71RNA进行快速准确的检测，为诊断肠道病毒71型感染提供可靠的实验依据。71型感染提供可靠的实验依据。71型感染提供可靠的实验依据。

【技术实现步骤摘要】
一种检测肠道病毒71型的引物和探针组合及其试剂盒


[0001]本专利技术属于体外检测试剂领域，具体涉及一种检测肠道病毒71型的引物和探针组合及其试剂盒。

技术介绍

[0002]肠道病毒是引起手足口病的病原体。至少20多种A组肠道病毒血清型可引起手足口病，以肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CV
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A16)、柯萨奇病毒A6型(CV
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A6)、柯萨奇病毒A10(CV
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A10)最为常见，其中，重症和死亡病例多数由EV
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A71感染所致。基于VP1基因序列差异可以将EV71分为A、B、C3个基因型，其中B与C又可分为5个基因亚型B1
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B5与C1
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C5。其中，中国主要流行的EV71型病毒为C4a亚型。
[0003]目前，肠道病毒71型检测的主要方法有：病毒分离培养法，但在病毒分离培养法中细胞增殖的培养技术操作复杂，技术及设备要求高，耗时长，不适合处理大量样本，且许多肠道病毒不能进行细胞培养，或者可以培养但不出现细胞病理效应；血清学检测法，该检测方法在疾病早期血液中较难检测到病毒抗体，不适用于早期诊断，且肠道病毒血清型众多，临床使用检测价值有限；基因序列测序法，基因序列测序法成本昂贵，步骤复杂繁琐，耗时长等缺点，临床检测不适宜使用。荧光PCR技术所用的荧光探针提高了检测的特异性和灵敏度，检测EV71 RNA较病毒分离培养法和血清学检测法都要敏感，而且对无症状感染者也能做出准确检测，能够对肠道病毒71型感染做出早期诊断。
[0004]然而，目前国内外已有基于实时荧光PCR技术检测EV71 RNA的试剂盒应用于临床检测中，但部分试剂盒由于样本处理方法、引物和探针设计位点、反应试剂耐受性不同而引起不同程度的假阴性，检测效率低、特异性不高。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供一种检测肠道病毒71型的引物和探针组合及其试剂盒，旨在提供可快速准确检测肠道病毒71型的试剂。
[0006]为达到此目的，本专利技术提供一种检测肠道病毒71型的引物和探针组合，所述检测肠道病毒71型的引物和探针组合包括：
[0007]EV71上游引物，所述EV71型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
[0008]EV71下游引物，所述EV71型下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；及，
[0009]EV71探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0010]可选地，所述探针的5
’
端标记有荧光基团，3
’
端标记有荧光淬灭基团。
[0011]可选地，所述荧光基团选自FAM、VIC、ROX或CY5中的任意一种；和/或，
[0012]所述荧光淬灭基团选自BHQ1或BHQ2中的一种。
[0013]可选地，所述检测肠道病毒71型的引物和探针组合还包括：
[0014]内标上游引物，所述内标上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
[0015]内标下游引物，所述内标下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；及，
[0016]内标探针，所述内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0017]此外，本专利技术还提供一种检测肠道病毒71型的试剂盒，所述检测肠道病毒71型的试剂盒包括EV71反应液、DNA聚合酶及逆转录酶，其中，所述EV71反应液包括PCR反应缓冲液、dNTPs及上述检测肠道病毒71型的引物和探针组合。
[0018]可选地，所述检测肠道病毒71型的试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。
[0019]可选地，所述EV71反应液中，所述PCR反应缓冲液的含量为2.5～5μL；和/或，
[0020]所述EV71反应液中，所述dNTPs的浓度为0.1～0.5μM；和/或，
[0021]所述EV71反应液中，所述EV71上游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
[0022]所述EV71反应液中，所述EV71上游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
[0023]所述EV71反应液中，所述EV71探针的浓度为0.1～1μM；和/或，
[0024]所述DNA聚合酶为Taq酶；和/或，
[0025]所述DNA聚合酶的活性为0.5～2U；和/或，
[0026]所述逆转录酶的活性为1～10U。
[0027]可选地，所述EV71反应液还包括核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的内标上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的内标下游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的内标探针；和/或，
[0028]所述EV71反应液还包括MgCl2；和/或，
[0029]所述dNTPs包括dATP、dUTP、dGTP及dCTP；和/或，
[0030]所述检测肠道病毒71型的试剂盒还包括内标质粒。
[0031]可选地，所述内标质粒包括果蝇靶序列；和/或，
[0032]所述EV71反应液中，所述内标上游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
[0033]所述EV71反应液中，所述内标下游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
[0034]所述EV71反应液中，所述内标探针的浓度为0.1～1μM。
[0035]此外，一种检测肠道病毒71型的方法，所述检测肠道病毒71型的方法包括以下步骤：
[0036]获取待检测样品；
[0037]将所述检测样品、阴性对照品及阳性对照品采用如权利要求6～9任一项所述的试剂盒进行PCR反应；
[0038]若PCR反应的扩增结果判定待检测样品的是否存在肠道病毒71型。
[0039]本专利技术中，通过基于肠道病毒71型高度保守序列筛选出的引物与探针组合，和可能存在同源性序列、其他肠道病毒、其他病原体等均无交叉反应，具有很好的特异性；同时，通过包含其的引物和探针组合的试剂盒检测肠道病毒71型，检测操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽，可以在较短的时间内对粪便等未知样本中的EV71 RNA进行快速准确的检测，为诊断肠道病毒71型感染提供可靠的实验依据。其检测结果可用于肠道病毒71型感染的辅助诊断，为肠道疾病的早期诊断以及高危人群的初筛提供分子诊断依据，适合推广。
附图说明
[0040]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现
有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0041]图1为实施例2检测样本为阳性的曲线图；
[0042]图2为实施例2检测样本为阴性的曲线图；
[0043]图3为实施例3检测阳性参考品和阴性参考品结果图；
[0044]图4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测肠道病毒71型的引物和探针组合，其特征在于，所述检测肠道病毒71型的引物和探针组合包括：EV71上游引物，所述EV71型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；EV71下游引物，所述EV71型下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；及，EV71探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。2.如权利要求1所述的检测肠道病毒71型的引物和探针组合，其特征在于，所述EV71探针的5
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端标记有荧光基团，3
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端标记有荧光淬灭基团。3.如权利要求2所述的检测肠道病毒71型的引物和探针组合，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、VIC、ROX或CY5中的任意一种；和/或，所述荧光淬灭基团选自BHQ1或BHQ2中的一种。4.如权利要求1所述的检测肠道病毒71型的引物和探针组合，其特征在于，所述检测肠道病毒71型的引物和探针组合还包括：内标上游引物，所述内标上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；内标下游引物，所述内标下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；及，内标探针，所述内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。5.一种检测肠道病毒71型的试剂盒，其特征在于，所述检测肠道病毒71型的试剂盒包括EV71反应液、DNA聚合酶及逆转录酶，其中，所述EV71反应液包括PCR反应缓冲液、dNTPs及如权利要求1～4所述的检测肠道病毒71型的引物和探针组合。6.如权利要求5所述的检测肠道病毒71型的试剂盒，其特征在于，所述检测肠道病毒71型的试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。7.如权利要求5或6所述检...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛丽丽，郑筱雯，陈明峰，
申请(专利权)人：深圳市国赛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：