一种用于异种移植供体猪多重病毒实时荧光检测的特异性引物、探针和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于异种移植供体猪多重病毒实时荧光检测的特异性引物、探针和试剂盒，通过对猪内源性反转录病毒(PERV)，猪流感病毒(SI)以及猪戊肝病毒(PHEV)的核酸序列进行比对分析，分别以PERV

【技术实现步骤摘要】
一种用于异种移植供体猪多重病毒实时荧光检测的特异性引物、探针和试剂盒


[0001]本专利技术属于核酸检测领域，本专利技术提供一种用于异种移植供体猪多重病毒的实时荧光检测方法，能够同时筛查供体猪内源性反转录病毒(PERV)，猪流感病毒(SI)以及猪戊肝病毒(PHEV)RNA的方法。
技术背景
[0002]目前器官移植面临的最大问题就是供体短缺，猪源性异种移植为大多数脏器功能衰竭又缺乏供体器官而死亡的患者提供了希望。然而随着猪供体器官移植到人体的同时，某些猪源病毒也有可能传染给人类并致病，猪巨细胞病毒(PCMV) 和猪淋巴性疱疹病毒(PLHV)在很大程度是种特异性的，通常不会感染人细胞。猪ADV和PCV2通常不会引起很严重的疾病，还没有传播到人类的报道。猪内源性逆转录病毒(Porcine endogenous retrovirus，PERV)已整合到猪的基因组中，它们会产生能够感染人类细胞的病毒颗粒，导致免疫缺陷和肿瘤，因此对异种移植构成特殊风险。猪流感是一种由甲型猪流感病毒(Swine influenza A,SI) 引起的猪呼吸系统疾病。中国卫生部门将原人感染猪流感称为甲型H1N1流感，猪戊肝病毒(Porcine hepatitis E virus PHEV)在猪身体内不会引起明显的疾病，却是经粪
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口途径传播的人兽共患病原体，临床上超过50％的急性肝炎病人为 HEV所致。HEV可以跨种间感染与传播，给人类健康和畜牧业生产造成巨大危害，并构成潜在的公共卫生问题。
[0003]PERV有三种亚型，PERV
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A，PERV
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B和PERV
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C。PERV
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A和PERV
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B存在于所有猪基因组，在体外能感染人类；PERV
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C只存在部分猪基因组且只能感染猪。但是PERV
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A/C的重组型在人类细胞培养中有很强的感染性。因此PERV的筛查检测应该涵盖三种病毒亚型。我们选择三型PERV均高度保守的PERV
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GAG基因 1332
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1430区段设计通用型引物和特异性探针。
[0004]甲型猪流感病毒(SI)分为三个亚型：H1N1,H1N2,H3N2,目前只有H1N1亚型可以感染多种动物，包括许多禽类和哺乳动物，具备了在人群中大流行的基本特征。我们设计能够检测甲型H1N1猪流感的引物和探针。
[0005]PHEV分为4个基因型，其中基因Ⅰ型和Ⅱ型仅感染人类；基因Ⅲ型和Ⅳ型为人畜共患病，其中猪为主要宿主，我们设计了能够筛查所有HEV的通用型引物。
[0006]PERV，SI，PHEV均为RNA病毒。本专利技术提供同时筛查供体猪内源性反转录病毒(PERV)，猪流感病毒(SI)以及猪戊肝病毒(PHEV)的实时荧光PCR检测方法。

技术实现思路

[0007]猪是目前公认的异种细胞、组织或器官移植研究的最佳供体，它具有与人类高度相似的基因组，且容易进行基因编辑和体外克隆。目前猪源性异种移植在全世界正处于临床前试验研究阶段。2020年1月2日《科学》杂志预测异种器官移植临床试验可能成为2020年度十大头条科学新闻。由于免疫抑制剂的大量使用，避免感染是决定移植手术成败和器官
移植后病人生存质量的关键因素。移植前筛选和鉴定健康供体猪和器官，对于降低移植后内源性病毒感染的风险十分重要。因此及早建立一个能快速检测异种器官移植多种病毒的方法对于器官供体猪和受体病人都有重要意义。实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，通过检测与靶序列互补的特异探针荧光信号的动态变化以扩增曲线方式实时反映PCR的每个循环的扩增水平。
[0008]为实现上述目的，本专利技术的技术方案采用Roche MagNAPure核酸试剂盒提取外周血或者呼吸道样本中的总核酸RNA，使用一步法实时荧光逆转录
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聚合酶链反应(Real time RT
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PCR)同时检测样本中PERV，SI，HEV的RNA数量。
[0009]本专利技术提供一种用于异种移植供体猪多重病毒实时荧光检测的特异性引物、探针，其特征在于，通过对已报导PERV,SI,HEV的核酸序列进行比对分析，分别以PERV
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GAG基因1332
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1430区段(三型PERV
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ABC均高度保守)，SI
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HA基因, HEV
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ORF3基因为扩增靶位点，选择无二级结构且高度保守的区段，根据引物探针设计的基本原则，利用引物分析软件和人工判断，并经多次实验优化后确定适合实时荧光定量Real Time
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PCR(RT
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PCR或qPCR)的多对引物和探针。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，
[0011]所述PERV病毒正反向引物及探针序列分别是：
[0012]正向引物：5'
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tgatcaggatgagagccgg
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3'，
[0013]反向引物：5'
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ttaaaccatggctaataaaccaaga
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3'，
[0014]Probe：5'
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FAM
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tgccaaatcttgccacgtaaggatataggg BHQ
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3'，
[0015]所述SI病毒正反向引物及探针序列分别是：
[0016]正向引物：5'
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gggaatatctcaaacctttcaaatg
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3'，
[0017]反向引物：5'
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acaaaggtgtaacggcagcat
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3'，
[0018]Probe：5'
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Fam
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cgagtcatgattgggccatgaacttgt
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3'，
[0019]所述PHEV病毒正反向引物及探针序列分别是：
[0020]正向引物：5'
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gtcaccccagaaaccacc
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3'，
[0021]反向引物：5'
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ttcatccaaccaacccct
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3'，
[0022]Probe：5'
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Fam
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gcgaagggctgagaatca
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BHQ1
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3'，
[0023]上述三对荧光探针分别在5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，所述荧光报告基团为FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ。也可以根据特殊的荧光报告基团选择相对应的荧光淬灭基团进行不同方式的多种组合以适应众多厂家多通道荧光PCR仪本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于异种移植供体猪多重病毒实时荧光检测的特异性引物、探针，其特征在于，通过对已报导PERV,SI,PHEV的核酸序列进行比对分析，分别以PERV
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GAG基因1332
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1430区段(三型PERV
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ABC均高度保守)，SI
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HA基因,PHEV
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ORF3基因为扩增靶位点，选择无二级结构且高度保守的区段，根据引物探针设计的基本原则，利用引物分析软件和人工判断，并经多次实验优化后确定适合实时荧光定量Real Time
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PCR(RT
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PCR或qPCR)的多对引物和探针。2.根据权利要求1所述的用于异种移植供体猪多重病毒实时荧光检测的特异性引物、探针，其特征在于，所述PERV病毒正反向引物及探针序列分别是：正向引物：5'
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tgatcaggatgagagccgg
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3'，反向引物：5'
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ttaaaccatggctaataaaccaaga
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3'，Probe：5'
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FAM
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tgccaaatcttgccacgtaaggatataggg BHQ
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3'，所述SI病毒正反向引物及探针序列分别是：正向引物：5'
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gggaatatctcaaacctttcaaatg
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3'，反向引物：5'
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acaaaggtgtaacggcagcat
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3'，Probe：5'
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Fam
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cgagtcatgattgggccatgaacttgt
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3'，所述PHEV病毒正反向引物及探针序列分别是：正向引物：5'
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gtcaccccagaaaccacc
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3'，反向引物：5'
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ttcatccaaccaacccct
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3'，Probe：5'
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Fam
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gcgaagggctgagaatca
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BHQ1
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3'，上述三对荧光探针分别在5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。3.根据权利要求2所述的用于异种移植供体猪多重病毒实时荧光检测的特异性引物、探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ。也可以根据特殊的荧光报告基团选择相对应的荧光淬灭基团进行不同方式的多种组合，以适应众多厂家多通道荧光PCR仪器的不同需求。如荧光报告基团可以选择FAM、VIC、CY3、ROX、CY5、TET、HEX、JOE等；淬灭基团选择与荧光基团相对应的淬灭基团如BHQ系列、TAMRA、DABCYL等。4.一种用于异种移植供体猪多重病毒实时荧光检测的特异性试剂盒，其特征在于，试剂盒包括PERV,SI,PHEV反应混合液、RNA人工内标(BIOLINE BIO38041)、阳性质控品、阴性质控品，所述反应混合液含有内标探针和如权利要求1至3任一所述的荧光RT
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PCR引物和荧光探针。5.根据权利要求4所述的一种用于异种移植供体猪多重病毒实时荧光检测的特异性试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：李旦，史金阳，郑炜，万建峰，
申请(专利权)人：杭州时轮医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：