一种用于新型冠状病毒COVID-19核酸检测的引物探针组合物及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于新型冠状病毒COVID

【技术实现步骤摘要】
一种用于新型冠状病毒COVID
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19核酸检测的引物探针组合物及其检测方法
[0001]
：本专利技术属于生物检测
，特别涉及一种用于新型冠状病毒COVID
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19核酸检测的引物探针组合物及其使用方法。
[0002]
技术介绍
：冠状病毒（Coronavirus，CoV）属巢状病毒目，冠状病毒科，是一类有包膜的正链RNA病毒，全长在26
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32kb之间，分为α、β、γ和δ四个属。α、β属仅对哺乳动物致病，γ属主要引起鸟类感染。新型冠状病毒（2019
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nCoV，SARS
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CoV
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2）属于β属，是目前引起人类呼吸道疾病的7种人冠状病毒（HCoV）之一，其他6种分别是HCoV
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229E、HCoV
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OC43、SARS
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CoV、HCoV
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NL63、HCoV
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HKU1、MERS
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CoV。2019
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nCoV引起的新型冠状病毒肺炎（COVID
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19）是急性呼吸道传染病，人群普遍易感。目前所见传染源主要是新型冠状病毒感染的患者，无症状感染者也可能成为传染源。基于目前的流行病学调查，潜伏期1
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14天，多为3
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7天。以发热、干咳、乏力为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状。
[0003]新型冠状病毒肺炎的传染性高且症状较为隐匿，根据WHO官网数据统计截止至2021年4月20日全球已累计确诊1亿4000多万例，死亡300多万例，对人类生命健康和社会经济的发展带来严重冲击，引起全球高度重视。目前，新型冠状病的检测方法有多种：
①
通过体外培养分离病毒的病原学检测方法，费时较长且分离阳性率不高，对生物安全性要求很高，不便于推广。
②
血清学方法，检测窗口期等待期较长，难以进行病毒感染的早期诊断。
③
实时荧光RT
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PCR检测新型冠状肺炎病毒是目前确诊阳性患者的主要标准，但基于荧光定量PCR技术的检测方法灵敏度有限，存在一定的漏检率，准确率不同公司也差异较大。以上几种方法均是定性判断，无法实现绝对定量。当前核酸分子的定量有三种方法，光度法基于核酸分子的吸光度来定量；实时荧光定量PCR（Real Time PCR）基于Ct值，Ct值就是指可以检测到荧光值对应的循环数；数字PCR是以终点PCR、有限稀释、柏松分布为基本原理的一种绝对定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。数字PCR主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号，根据泊松分布原理及阴阳性微滴的个数与比例可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，进而实现绝对定量。其无需标准曲线和参照样本就能直接检测目标序列的拷贝数，具有比传统RT
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PCR更高的灵敏度、特异性和精确性，尤其是在极微量的核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面展现出巨大的优势。数字PCR过程大致分为微反应单元的形成、PCR扩增和微反应单元中扩增信号的检测与统计分析三大步。其中微反应单元的形成方式有物理分区和机械分区两种，前者以采用微流控技术形成油包水的微滴来实现物理分区的Bio
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Rad公司的QX200微滴式数字PCR系统为典型代表，后者以通过特制含有上万个微反应孔的硅芯片直接进行机械分区的LifeTechnologies公司QuantStudio 3D数字PCR系统为典型代表；PCR扩增，有PCR管式（如
Bio
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Rad）和芯片式（如Life Technologies QuantStudio 3D的微反应孔硅芯片，或如苏州锐迅的单层微滴平铺芯片）两种形式。两种扩增方式各有利弊。芯片式扩增因微滴呈现单层平铺形式加热表面积增大、导热速度较快，故其扩增时间可适当缩短，但检测通量略低，多数一次反应只能检测8、16或24个样本。Bio
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Rad的PCR管式扩增导热速度较慢些、扩增时间略长，但检测通量高达96个样本。扩增结束后微反应单元中扩增信号的检测，Bio
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Rad采用的是类似于流式细胞仪的方法逐个检测每个微滴的荧光信号，Life Technologies、苏州锐讯、浙江达普等公司数字PCR仪器采用的CCD或激发光拍照的形式获取扩增信号，最后均是根据泊松分布原理及阴阳性微反应的个数比例推算出靶分子的起始拷贝数或浓度。相比物理分区的微反应孔硅芯片，油包水微滴式数字PCR系统成本更低、体系稳定性、均匀性及可操作性也略好些，因此目前Bio
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Rad公司的QX200微滴式数字PCR系统占据了绝大部分市场。近几年陆续出现的国产数字PCR设备也多是采用微滴式数字PCR原理，但微滴生成卡形式和PCR扩增耗材略有差异，单层微滴平铺芯片加CCD拍照式分析方式居多。 数字PCR跟qPCR最主要的区别就是需把一个反应体系分散成数万个微滴或微室，需要加一些与油相相匹配的稳定剂要维持油包水微滴的稳定性。目前不同的数字PCR厂家采用的微滴生成油成分略不同，故对应的稳定剂也不同，一般这些特有的稳定剂会被预混在酶体系里组合出售，搭配其数字PCR使用。不同的数字PCR仪器配套的酶体系不同，由于扩增时DNA聚合酶对底物序列具有偏好性，故即使是同种病原体在不同的数字PCR仪器平台上检测所需筛选的最佳引物探针组合也不同。目前在新型冠状病毒的数字PCR核酸检测方面的专利报道尚不多，专利号CN111118225A公布的是在苏州锐讯数字PCR仪器及其配套酶体系基础上开发的一种新型冠状病毒核酸检测微滴式数字PCR试剂盒及其应用，CN111088405A公布的是配套LifeTechnologies公司QuantStudio 3D数字PCR系统使用的用于检测冠状病毒2019
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nCoV的引物探针组合物、试剂盒及方法。由于这两种专利报告的引物探针组合物是在其专用的仪器试剂平台上开发的，对目前市场上应用最多检测通量最高的Bio
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Rad QX200微滴式数字PCR系统的适用性不佳。因此，目前仍需开发一种新的灵敏度更高、特异性更强且性能更稳定的适配于Bio
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Rad QX200微滴式数字PCR系统的新冠病毒检测诊断方法，以弥补现有的荧光定量PCR检测试剂盒存在的假阴性和灵敏度不足。
[0004]公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0005]
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于新型冠状病毒COVID
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19核酸检测的引物探针组合物，其特征在于：包括：针对COVID
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19的ORF1ab基因特异性引物为SEQIDNO.1所示的正向引物和SEQIDNO.2所示的反向引物；针对COVID
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19的N基因引物为SEQIDNO.3所示的正向引物和SEQIDNO.4所示的反向引物。2.一种用于新型冠状病毒COVID
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19核酸检测的引物探针组合物，其特征在于：包括：针对COVID
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19的ORF1ab基因探针为SEQIDNO.3；针对COVID
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19的N基因探针为SEQIDNO.6。3.根据权利要求2所述的用于新型冠状病毒COVID
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19核酸检测的引物探针组合物，其特征在于：所述SEQIDNO.5所示的探针5
’
端标记有FAM、3
’
端标记有BHQ1；所述SEQIDNO.6所示的探针5
’
端标记有HEX/VIC、3
’
端标记有BHQ1。4.一种用于新型冠状病毒COVID
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19核酸定量检测的方法，其特征在于：具体包括如下...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭莉，张蓉，贺华，陈永红，吴惟茜，杨静，郭玉婉，赵西浩，李秀林，刘中华，王国强，
申请(专利权)人：江苏硕世生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：