一种鉴定新型冠状病毒的引物组、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鉴定新型冠状病毒的引物组、试剂盒及其应用。引物组包括如第1引物对至第168引物对中的至少一对，每个引物对均包括正向引物和反向引物，第1引物对的正向引物、第1引物对的反向引物至第168引物对的正向引物和第168引物对的反向引物依次如序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：336所示的引物。本发明专利技术提供的引物组对新型冠状病毒基因组上的168个MNP标记位点具有较高的扩增特异性和稳定性；使用该引物组的试剂盒对新型冠状病毒的鉴定具有良好的灵敏度、重现率和准确率，可用于非诊断目的的新型冠状病毒的定性鉴定、定量鉴定、遗传变异鉴定、指纹数据库构建和新型冠状病毒的精细分型鉴定与溯源。病毒的精细分型鉴定与溯源。病毒的精细分型鉴定与溯源。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定新型冠状病毒的引物组、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种鉴定新型冠状病毒的引物组、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]冠状病毒在系统分类上属冠状病毒属(Coronavirus)，基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛 存在的一大类病毒。2019爆发的目前仍在世界范围内流行的新冠肺炎的病原菌新型冠状病毒(2019
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nCoV或 SARS
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CoV
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2)，是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒。
[0003]新冠肺炎爆发后，包括美国thermo scientific、华大基因公司等国内多家机构陆续推出了基于测序技术 检测新型冠状病毒的方法或试剂盒。已有的基于二代测序技术的检测均是通过检测新型冠状病毒基因组上的单 核苷酸(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)变异对新冠病毒进行鉴定和变异分析。SNP标记是二态性 标记，在对包括病毒在内的以群体形式存在的微生物进行鉴定时，存在多态性低，分型错误率高的缺陷，且现 有技术不能用于测定样本中新型冠状病毒的绝对的拷贝数，这不利于新型冠状病毒的检测。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术的问题，本专利技术实施例提供了一种鉴定新型冠状病毒的引物组、试剂盒及其应用。所述 技术方案如下：
[0005]一方面，本专利技术提供了一种鉴定新型冠状病毒的引物组，所述引物组包括第1引物对至第168引物对中的 至少一对，每个所述引物对均包括正向引物和反向引物，所述第1引物对的正向引物、所述第1引物对的反向 引物至所述第168引物对的正向引物和第168引物对的反向引物依次如序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO： 336所示。
[0006]另一方面，本专利技术实施例提供了一种鉴定新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物组。
[0007]具体地，所述试剂盒还包括如序列表中SEQ ID NO：337至SEQ ID NO：346所示的9个内标DNA。
[0008]具体地，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
[0009]又一方面，本专利技术实施例提供了一种引物组的应用，所述应用包括：利用所述引物组对新型冠状病毒基因 组上的168个MNP标记位点中的至少一个进行检测，根据获得的MNP标记位点的序列进行非诊断目的的新型冠 状病毒的定性鉴定、定量鉴定、遗传变异鉴定、MNP指纹数据库的构建和精细分型。
[0010]本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本专利技术实施例提供的引物组对新冠病毒基因组上168个 MNP标记位点进行检测，且检测结果具有较高的扩增特异性和稳定性，使用该引物组的试剂盒对新型冠状病毒 的检测同具有良好的灵敏度、重现率和准确
率。该引物组针对本专利技术实施例提供的MNP标记位点进行检测，能 够用于非诊断目的的新型冠状病毒的定性鉴定、定量鉴定、遗传变异鉴定、MNP指纹数据库的构建和精细分型。
附图说明
[0011]为了更清楚地说明本公开实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性 劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0012]图1是本公开实施例提供的用于新型冠状病毒定量的标准曲线图。
具体实施方式
[0013]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施方式作进一步地详细描述。
[0014]本专利技术实施例提供的新型冠状病毒的来源为湖北省疾病预防控制中心赠予。
[0015]实施例一
[0016]本专利技术提供了一种鉴定新型冠状病毒的引物组，该引物组包括第1引物对至第168引物对中的至少一对， 每个引物对均包括正向引物和反向引物，第1引物对的正向引物、第1引物对的反向引物至第168引物对的正 向引物和第168引物对的反向引物依次如序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：336所示。
[0017]在实现时，可以对引物组的碱基进行修饰。
[0018]本专利技术实施例提供了一种鉴定新型冠状病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组。
[0019]具体地，该试剂盒还可以包括如序列表中SEQ ID NO：337至SEQ ID NO：346所示的9个内标DNA。
[0020]具体地，该试剂盒还可以包括多重PCR预混液。
[0021]本专利技术实施例提供了一种引物组的应用，利用引物组对新型冠状病毒基因组上的168个MNP标记位点中的 至少一个进行检测，用于非诊断目的的新型冠状病毒的定性鉴定、定量鉴定、遗传变异鉴定、MNP指纹数据库 的构建和新型冠状病毒的精细分型。同时，本专利技术实施例提供的引物组及其对应的MNP标记位点如表1所示。
[0022]表1为引物组的序列以及对应的MNP标记位点
[0023][0024][0025][0026][0027][0028][0029][0030]评估该引物组的性能，具体如下：
[0031]将拷贝数已知的SARS
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CoV
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2的核糖核酸国家标准品(GBW(E)091099)加入到2ng人基因组DNA中，该人 基因组DNA的来源为本实验室保存的人Huh
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7细胞系，分别制备成1拷贝/检验、10拷贝/检验和100拷贝/检 验的新型冠状病毒模拟样本，同时，在每个模拟样本中加入1μL的内标DNA，同时设置由无菌水和1μL内标 DNA组成的两种阴性对照。结果共计检测了如表2所示的2个阴性对照、1拷贝/检验、10拷贝/检验和100拷 贝/检验共计5个样本。每天使用本专利技术实施例提供的试剂盒对5个样本进行扩增，每次扩增进行3次重复，得 到扩增产物，将该扩增产物连接上购买的商业化样本标签，获得适用于高通量测序的文库。连续构建4天，即 每个样本获得12个文库，5个样本共计获得60个文库。将60个文库按照等摩尔量进行混合，混合后进行高通 量测序。
[0032]内标DNA的制备方法具体如下：
[0033]从本专利技术实施例提供的168个MNP标记位点中选择1个或多个MNP标记位点；
[0034]针对选择的每个MNP标记位点，分别设计至少3条与所选的MNP标记位点扩增引物一致，且扩增区长度相 同，但是DNA序列与所有MNP标记位点均不同的DNA序列，本实施例设置3条DNA序列；
[0035]将上述每条DNA序列连接到质粒载体上，生成3条DNA质粒模板；
[0036]对3条DNA质粒模板单位体积的拷贝数进行定量，并按比例混合，获得单位体积(每μL)含3个DNA质粒 模板分别是10拷贝、100拷贝和1000拷贝的内标DNA。
[0037]为了保证定量的准确性，本实施例选择3个MNP标记位点，共获得3套内标DNA，共产生如序列表中SEQ IDNO：337至SE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定新型冠状病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括第1引物对至第168引物对中的至少一对，每个所述引物对均包括正向引物和反向引物，所述第1引物对的正向引物、所述第1引物对的反向引物至所述第168引物对的正向引物和第168引物对的反向引物依次如序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：336所示。2.一种鉴定新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如序列表中SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：江永忠，方斌，高利芬，彭海，方治伟，李论，刘琳琳，叶国军，蔡昆，霍细香，雷亚克，
申请(专利权)人：武汉明了生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：