一种用于碱性磷酸酶检测的可视化检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于碱性磷酸酶检测的可视化检测方法，包括以下步骤：S1：提供4

【技术实现步骤摘要】
一种用于碱性磷酸酶检测的可视化检测方法


[0001]本申请涉及酶检测
，尤其涉及一种用于碱性磷酸酶检测的可视化检测方法。

技术介绍

[0002]碱性磷酸酶(ALP)是一种哺乳动物组织中的重要水解酶，具有催化磷酸酯的水解和磷酸化功能。作为医疗诊断的关键生物标记物，ALP主要存在于肝脏、肾脏、肠道、骨骼和血清中，健康成人血清中ALP浓度大小范围为46～190mU/mL，若表达水平异常，会造成心力衰竭、肾功能恶化、肝功能障碍、胆汁淤积、血管钙化、骨病和乳腺癌等疾病。为了保护人类健康，对ALP进行早期诊断与检测是迫在眉睫的事情。迄今为止，对ALP的检测方法主要包括：比色法、表面增强拉曼散射法、电化学分析法和色谱分析法等。在这些检测方法中，荧光检测技术因其固有的优势，如高灵敏度、实时检测和原位成像的特点而被广泛关注。目前，有机荧光分子、半导体量子点、金纳米簇、铜纳米簇等多种荧光材料被用于ALP的检测中。但是有机荧光探针水溶性较差，半导体量子点毒性较大，荧光共聚物制备步骤复杂且费时，贵金属纳米簇成本较高且稳定性差。因此，开发能够简便、灵敏检测ALP活性的方法是当前研究的重点。
[0003]水凝胶是高分子聚合物经化学键合或物理缠绕交联而成的，以水为分散介质的具有三维网络结构的高分子材料。琼脂糖是重要的水溶性聚合物之一，具有良好的亲水性，并几乎完全不存在带电基团，对敏感的生物大分子极少引起变性和吸附，是理想的惰性载体。琼脂糖水凝胶不仅具有良好的生物相容性，还具有可降解性和无毒性。基于荧光探针制备的水凝胶传感器，可以利用原位生成碳点的荧光信号，用于酶活性的可视化检测。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中的缺陷，本专利技术提出了一种用于碱性磷酸酶检测的可视化检测方法，包括以下步骤：
[0005]S1：提供4
‑
氨基苯磷酸钠盐、琼脂糖及缓冲液，将所述4
‑
氨基苯磷酸钠盐与所述琼脂糖添加至所述缓冲液中，获得第一混合液；
[0006]S2：加热搅拌使所述第一混合液中的所述琼脂糖充分融化后，将液体倒入模具，冷却形成第一固态交联物；
[0007]S3：在所述第一固态交联物表面添加待测碱性磷酸酶，加热生成第二固态交联物；
[0008]S4：在所述第二固态交联物表面添加(3
‑
氨基丙基)三甲氧基硅烷液体，继续加热生成第三固态交联物
[0009]S5：将所述第三固态交联物置于紫外分析仪下，在365nm激发光下观察所述第三固态交联物的荧光颜色。
[0010]在其中一个实施例中，所述第一混合液中4
‑
氨基苯磷酸钠盐溶液的浓度为1
‑
100mM，所述琼脂糖占所述第一混合液中的质量的0.5％
‑
5％。
[0011]在其中一个实施例中，所述步骤S2的加热温度为100
‑
160℃，加热时间为5
‑
10min。
[0012]在其中一个实施例中，所述步骤S3的加热温度为40
‑
90℃，加热时间为15
‑
120min。
[0013]在其中一个实施例中，所述步骤S4的加热温度为30
‑
90℃，加热时间为10
‑
100min。
[0014]在其中一个实施例中，所述(3
‑
氨基丙基)三甲氧基硅烷液体与所述第一固态交联物的体积比为1:2
‑
1:1。
[0015]在其中一个实施例中，所述缓冲液为二乙醇胺缓冲液、伯瑞坦
‑
罗宾森缓冲液、柠檬酸
‑
柠檬酸钠缓冲液中的任意一种，且所述缓冲液的pH值为8.0
‑
10.2。
[0016]在其中一个实施例中，在步骤S1完成后，进行步骤S2之前，还包括步骤S2a：向所述第一混合液中加入参比物。
[0017]在其中一个实施例中，所述参比物为罗丹明、荧光碳量子点、荧光硅量子点、荧光CdTe量子点中的至少一种，所述参比物在紫外光照下呈现红色。
[0018]在其中一个实施例中，所述参比物在反应体系中的浓度为0.01
‑
0.1mg/mL。
[0019]这种可视化检测方法步骤非常简单，仅通过低温加热冷却即可得到形状尺寸可控的水凝胶传感器。通过将待测物滴加到水凝胶传感器表面加热并结合紫外灯下观察到水凝胶传感器明显的颜色变化，即可实现碱性磷酸酶的可视化半定量检测，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0020]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明：
[0021]图1示出了本专利技术实施例水凝胶传感器制备及检测的步骤流程图；
[0022]图2示出了本专利技术实施例水凝胶传感器的检测效果图。
具体实施方式
[0023]为了更详细地阐明本专利技术，下面结合优选实施例和附图对本专利技术的技术方案做进一步阐述。
[0024]结合图1
‑
2，在本申请中，提出了一种用于碱性磷酸酶检测的可视化检测方法，包括以下步骤：
[0025]S1：提供4
‑
氨基苯磷酸钠盐、琼脂糖及缓冲液，将所述4
‑
氨基苯磷酸钠盐与所述琼脂糖添加至所述缓冲液中，获得第一混合液；
[0026]S2：加热搅拌使所述第一混合液中的所述琼脂糖充分融化后，将液体倒入模具，冷却形成第一固态交联物；
[0027]S3：在所述第一固态交联物表面添加待测碱性磷酸酶，加热生成第二固态交联物；
[0028]S4：在所述第二固态交联物表面添加(3
‑
氨基丙基)三甲氧基硅烷液体，继续加热生成第三固态交联物；
[0029]S5：将所述第三固态交联物置于紫外分析仪下，在365nm激发光下观察所述第三固态交联物的荧光颜色。
[0030]本专利技术运用的原理是4
‑
氨基苯磷酸钠盐经碱性磷酸酶催化作用后，去除磷酸基团且进一步与(3
‑
氨基丙基)三甲氧基硅烷液体发生席夫碱反应，从而生成淡蓝色荧光碳点，不同用量的碱性磷酸酶得到的碳点的荧光信号不同，即可以通过收集荧光信号得到相应的
碱性磷酸酶的用量。
[0031]在一些优选的实施方案中，还可在检测过程中加入参比物，进行比率荧光探针的搭建，提高不同浓度碱性磷酸盐在紫外光照下的荧光色差，进一步提升对碱性磷酸酶的可视化检测效果。优选地，参比物可以是罗丹明、荧光碳量子点、荧光硅量子点、荧光CdTe量子点中的至少一种，这些参比物在紫外光照下呈现红色，与反应系统中的蓝色荧光碳量子点形成明显的颜色对比，对于不同浓度的碱性磷酸酶检测可以获得更明显的颜色渐变信息，可明显提升检测的可视化效果。
[0032]其中步骤S1和步骤S2通过底物的加入和凝胶的制备，进行了水凝胶传感平台的搭建。通过大量实验探究最佳反应条件时可得知，优选地，所述琼脂糖占所述第一混合液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于碱性磷酸酶检测的可视化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：提供4
‑
氨基苯磷酸钠盐、琼脂糖及缓冲液，将所述4
‑
氨基苯磷酸钠盐与所述琼脂糖添加至所述缓冲液中，获得第一混合液；S2：加热搅拌使所述第一混合液中的所述琼脂糖充分融化后，将液体倒入模具，冷却形成第一固态交联物；S3：在所述第一固态交联物表面添加待测碱性磷酸酶，加热生成第二固态交联物；S4：在所述第二固态交联物表面添加(3
‑
氨基丙基)三甲氧基硅烷液体，继续加热生成第三固态交联物；S5：将所述第三固态交联物置于紫外分析仪下，在365nm激发光下观察所述第三固态交联物的荧光颜色。2.根据权利要求1所述的用于碱性磷酸酶检测的可视化检测方法，其特征在于，所述第一混合液中4
‑
氨基苯磷酸钠盐溶液的浓度为1
‑
100mM，所述琼脂糖占所述第一混合液中的质量的0.5％
‑
5％。3.根据权利要求1所述的用于碱性磷酸酶检测的可视化检测方法，其特征在于，所述步骤S2的加热温度为100
‑
160℃，加热时间为5
‑
10min。4.根据权利要求1所述的用于碱性磷酸酶检测的可视化检测方法，其特征在于，所述步骤S3的加热温度为40
‑
90℃，加热时间为15
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉菲，韩亚琴，张佳婧，张国秀，杨达，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：