一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，包括以下步骤：S1：将4

【技术实现步骤摘要】
一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法及试剂盒


[0001]本申请涉及酶检测
，尤其涉及一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]碱性磷酸酶(ALP)是一种哺乳动物组织中的重要水解酶，具有催化磷酸酯的水解和磷酸化功能。作为医疗诊断的关键生物标记物，ALP主要存在于肝脏、肾脏、肠道、骨骼和血清中，健康成人血清中ALP活性范围为46～190mU/mL，若表达水平异常，会造成心力衰竭、肾功能恶化、肝功能障碍、胆汁淤积、血管钙化、骨病和乳腺癌等疾病。为了保护人类健康，对ALP进行早期诊断与检测是迫在眉睫的事情。迄今为止，对ALP的检测方法主要包括：比色法、表面增强拉曼散射法、电化学分析法和色谱分析法等。在这些检测方法中，荧光检测技术因其固有的优势，如高灵敏度、实时检测和原位成像的特点而被广泛关注。目前，有机荧光分子、半导体量子点、金纳米簇、铜纳米簇等多种荧光材料被用于ALP的检测中。但是有机荧光探针水溶性较差，半导体量子点毒性较大，荧光共聚物制备步骤复杂且费时，贵金属纳米簇成本较高且稳定性差。因此，开发能够用于人类血清中快速、简便、灵敏检测ALP活性的方法是当前研究的重点。

技术实现思路

[0003]针对现有技术中的缺陷，本专利技术提出了一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，包括以下步骤：
[0004]S1：将4
‑
氨基苯磷酸钠盐添加至缓冲液中，获得第一混合液；
[0005]S2：在所述第一混合液中，加入碱性磷酸酶得到第二混合液；
[0006]S3：加热使所述第二混合液反应后得到第三混合液；
[0007]S4：在所述第三混合液中，加入(3
‑
氨基丙基)三甲氧基硅烷液体，继续加热得到第四混合液；
[0008]S5：通过荧光光谱仪收集所述第四混合液在455nm处的发射峰强度，并通过发射峰强度计算碱性磷酸酶的活性。
[0009]在其中一个实施例中，所述第一混合液中4
‑
氨基苯磷酸钠盐溶液的浓度为1
‑
100mM。
[0010]在其中一个实施例中，所述步骤S3的加热温度为40
‑
90℃，所述步骤S3的加热时间为15
‑
120min。
[0011]在其中一个实施例中，步骤S4中所述(3
‑
氨基丙基)三甲氧基硅烷液体与所述第三混合液的体积比为1:7
‑
3:4。
[0012]在其中一个实施例中，步骤S4的加热温度为30
‑
90℃，加热时间为10
‑
100min。
[0013]在其中一个实施例中，在步骤S4完成后，进行步骤S5之前，还包括步骤S5a：向所述第四混合液中加入参比物。
[0014]在其中一个实施例中，所述参比物为罗丹明、荧光金纳米团簇、荧光碳量子点、荧光硅量子点、荧光CdTe量子点中的至少一种，所述参比物在紫外光照下呈现红色。在其中一个实施例中，所述参比物在反应体系中的浓度为0.01
‑
0.1mg/mL。
[0015]本专利技术相较于现有技术，其有益效果在于，仅通过低温加热和原位碳点的生成，实现对碱性磷酸酶的高精度、可视化检测。具有选择性好，灵敏度高的特点，检出限低至0.075μU/mL，可用于人体血清中或其他环境中对碱性磷酸酶进行灵敏检测，具有广阔的应用前景。
[0016]另一方面，本专利技术还提出一种用于碱性磷酸酶的高灵敏荧光检测的试剂盒，包括：缓冲液、4
‑
氨基苯磷酸钠盐、(3
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氨基丙基)三甲氧基硅烷液体，所述试剂盒通过权利要求1所述的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法实现对碱性磷酸酶活性的检测。
[0017]在其中一个实施例中，还包括参比物，所述参比物为罗丹明、荧光金纳米团簇、荧光碳量子点、荧光硅量子点、荧光CdTe量子点中的至少一种，所述参比物在紫外光照下呈现红色，通过比率荧光探针的构建，将检测精度提高一个数量级。
[0018]这种试剂盒仅通过较低温度的加热，再结合常用的紫外灯，即可实现对碱性磷酸酶的裸眼可视化、快速、高灵敏检测，成本低，效率高，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0019]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明：
[0020]图1示出了本专利技术实施例对碱性磷酸酶的检测方法的步骤流程图；
[0021]图2示出了本专利技术实施例S1
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S3步骤的最佳反应条件：(a)4
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氨基苯磷酸钠盐浓度；(b)缓冲液pH；(c)二乙醇胺浓度；(d)温度；(e)反应时间；
[0022]图3示出了本专利技术实施例S4步骤的最佳反应条件：(a)温度；(b)反应时间；(c)APTMS与第三混合液的体积比；
[0023]图4示出了本专利技术实施例荧光法检测ALP的光谱及线性关系；
[0024]图5示出了本专利技术实施例中制备的CDs的TEM照片；
[0025]图6示出了本专利技术实施例中制备的CDs的XRD数据；
[0026]图7示出了本专利技术实施例中制备的CDs的XPS数据；
[0027]图8示出了本专利技术实施例中制备的CDs的FTIR数据；
[0028]图9示出了本专利技术实施例比率荧光法检测ALP的光谱及线性关系；
[0029]图10示出了本专利技术实施例检测ALP的特异性数据。
具体实施方式
[0030]为了更详细地阐明本专利技术，下面结合优选实施例和附图对本专利技术的技术方案做进一步阐述。
[0031]结合图1
‑
10，在本申请中，提出了一种可视化的、低成本且高灵敏度的对碱性磷酸酶的荧光检测方法，首先通过以下的步骤确定对碱性磷酸酶的检测限：
[0032]将4
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氨基苯磷酸钠盐(APP)添加至缓冲液中，获得第一混合液；将所述第一混合液均分为若干份，除去一份不加碱性磷酸酶(ALP)作为空白对照组外，分别加入不同活性的碱性磷酸酶得到第二混合液；随后，加热使各组所述第二混合液反应后得到多组第三混合液；
在多组第三混合液中，分别加入定量(3
‑
氨基丙基)三甲氧基硅烷液体(APTMS)，继续加热得到第四混合液；通过荧光光谱仪收集所述第四混合液在455nm处的发射峰强度，并根据发射峰强度计算碱性磷酸酶的活性。通过调节4
‑
氨基苯磷酸钠盐的浓度、缓冲液pH值、加热反应温度或加热反应时间，确定了灵敏度最高的检测条件。在大量的探索实验中，参考图2，在APP浓度为25mM，缓冲液为DEA且缓冲液的pH值为9.4且浓度为1M，加热温度为70℃且加热时间为105min的情况下，得到的产物碳量子点(CDs)的荧光强度最大，相应地对ALP的检测灵敏度和检测效率最佳。
[0033]在得到上述最优条件后，按照该条件制备若干份第三混合液，分别加入不同体积比的APTMS溶液，继续加热得到第四混合液；通过本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将4
‑
氨基苯磷酸钠盐添加至缓冲液中，获得第一混合液；S2：在所述第一混合液中，加入碱性磷酸酶得到第二混合液；S3：加热使所述第二混合液反应后得到第三混合液；S4：在所述第三混合液中，加入(3
‑
氨基丙基)三甲氧基硅烷液体，继续加热得到第四混合液；S5：通过荧光光谱仪收集所述第四混合液在455nm处的发射峰强度，并根据发射峰强度计算碱性磷酸酶的活性。2.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的荧光检测方法，其特征在于，所述第一混合液中4
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氨基苯磷酸钠盐溶液的浓度为1
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100mM。3.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的荧光检测方法，其特征在于，所述步骤S3的加热温度为40
‑
90℃，所述步骤S3的加热时间为15
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120min。4.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的荧光检测方法，其特征在于，步骤S4中所述(3
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氨基丙基)三甲氧基硅烷液体与所述第三混合液的体积比为1:7
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3:4。5.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的荧光检测方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉菲，韩亚琴，张国秀，张佳婧，李美铮，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：