一种带有内部荧光的表面可修饰纳米颗粒及其在miRNA检测中的应用制造技术

本发明专利技术属于miRNA荧光检测技术领域，提供一种带有内部荧光的表面可修饰纳米颗粒及其在miRNA检测中的应用。该带有内部荧光的表面可修饰纳米颗粒，主要由内部的CdTe量子点荧光团及其外依次包覆的二氧化硅壳层和聚多巴胺壳层三部分组成。利用CdTe量子点荧光峰在630nm处附近，纳米颗粒表面的单链脱附后形成的双链使530nm处附近出现SG1的荧光峰，构建一个检测miRNA的比率型荧光探针。通过对I

【技术实现步骤摘要】
一种带有内部荧光的表面可修饰纳米颗粒及其在miRNA检测中的应用


[0001]本专利技术属于miRNA荧光检测
，涉及一种复合材料CdTe@SiO2@PDA的制备及其作为非标记型荧光探针在miRNA比率荧光检测中的应用。

技术介绍

[0002]MicroRNA(miRNA)是一种内源性的单链非编码RNA，一般含有18
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25个核苷酸。MiRNA参与了多种生物学和细胞过程，包括免疫应答、造血分化、脂肪代谢、细胞增殖等；同时，miRNA的异常表达与多种疾病的发生有关，可以作为各种疾病的诊断标记和治疗靶标。例如在乳腺癌患者的血清中，miRNA
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21、miRNA
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210和miRNA
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1246的表达水平较高，具有一定的诊断价值。因此实现细胞内miRNA的可视化检测对于疾病早期诊断和治疗干预至关重要。由于miRNA在细胞中的表达丰度较低，易降解，并且同家族之间序列相似性极高，所以对它的检测比较困难。传统的miRNA检测方法有最早建立的Northern印迹法，需要大量的检测样本，定量逆转录法需要精准控温，增加了实验复杂性，而微阵列法检测法的灵敏度低和重现性差。因此近年来发展了一系列新型的miRNA检测方法，比如电化学发光法、拉曼光谱法、荧光法、质谱法结合信号放大等方法。其中荧光法是一种基于分子信标或者纳米材料的检测策略，其操作简单，响应快速且检测灵敏；并且荧光成像可以实现细胞水平上目标物的分析检测，因此荧光法近年来得到了广泛的应用。
[0003]荧光传感器作为传感器的一个特殊子集，由于其高灵敏度和技术简单而在分析传感和光学成像方面引起了极大的关注。理想情况下，荧光传感器应该在与目标相关的条件下以可靠的方式响应目标分析物。靶标与探针之间的相互作用通过猝灭(开
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关开关)降低荧光强度，或者通过消除猝灭效应(关
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开开关)增强荧光强度。关
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开开关通常能够比开
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关开关提供更高的信噪比。然而，只使用波长上的发射强度来定量目标分析物有时可能会有问题，因为干扰可能来自各种与分析物无关的因素，如样品基质的光散射、激发源波动、探针周围的微环境以及探针局部浓度的变化等。
[0004]为了克服这些缺点，可以考虑另一个荧光光谱峰，也就是所谓的比率荧光。根据定义，比率荧光传感器从不同波长的两个或多个发射波段收集分析引起的荧光强度变化。与许多其他分析方法中使用的内参比法一样，比率荧光传感的特点是提高了信噪比，因此能够更可靠的定量。比率型荧光探针是利用两个荧光信号的比值来判断目标物的存在，这种探针要求两种染料分别在不同波长处发射且间隔足够大，并且荧光易于区分。比率荧光相对单一信号变化，能够消除环境等因素干扰，提高结果的准确性。目前已有的比率型荧光探针多用于检测金属离子、生物大分子、检测环境pH等，在检测miRNA方面，大多数文献报道的探针载体包括金纳米粒、金属有机框架等，检测限在纳摩级别，表现出较高的选择性和灵敏度，并且能够有效避免背景干扰所产生的假阳性信号。
[0005]目前已发展的比率型荧光探针大多存在材料不易降解的问题，而且大多需要双标记或单标记荧光团，标记过程不仅会降低探针对靶标的结合能力，也会增加检测的成本。而
免标记型的荧光探针不仅合成步骤简单，成本低廉，还可以免受标记荧光团的干扰，对目标基因的亲和力更强。因此，我们设计合成了一种免标记型比率荧光探针，用于检测特定序列的miRNA。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种针对miRNA检测的比率型荧光探针。本专利技术通过设计合成一种非标记型荧光探针，用于选择性检测特异性序列的miRNA，实现特定miRNA的比率检测的目的。具有灵敏度高、选择性好等优点。
[0007]本专利技术的技术方案：
[0008]一种带有内部荧光的表面可修饰纳米颗粒，主要由内部的CdTe量子点荧光团及其外依次包覆的二氧化硅壳层和聚多巴胺壳层三部分组成，称为CdTe@SiO2@PDA；其中CdTe量子点荧光团集中包覆在均匀的二氧化硅壳层中间，进一步包覆均匀的聚多巴胺层，构成核
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壳
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壳结构。以具有强烈荧光发射的CdTe量子点为核，聚集在二氧化硅内部，二氧化硅壳起到降低量子点毒性、增大量子点与聚多巴胺之间的距离的作用，通过表面氨基化连接二氧化硅层与聚多巴胺层。
[0009]所述的表面可修饰纳米颗粒的粒径为120～180nm。
[0010]以带有内部荧光的表面可修饰纳米颗粒为荧光探针检测原理如下：非标记型比率荧光探针由内部的CdTe量子点荧光团及其外层包覆的二氧化硅壳层及聚多巴胺壳层、外部的游离信号荧光团SG1和特定序列的DNA单链识别探针组成。内部量子点荧光作为参比信号，其荧光强度不随环境改变而变化，当探针识别到特定序列的目标链时，形成DNA双链结构，由于刚性，双链远离聚多巴胺表面，游离染料SG1可以嵌进双链碱基对中发出荧光，即可与内部参比荧光强度形成比率，实现目标miRNA的高选择性和高灵敏度检测。设计重点：确保二氧化硅壳层的厚度使量子点远离聚多巴胺层，CdTe的荧光强度一定，目标链与表面互补单链形成双螺旋结构远离聚多巴胺时，插入双链的SG1荧光信号被点亮，而内部CdTe的荧光信号保持不变，从而实现对特定miRNA的比率型荧光检测。
[0011]所述的基于CdTe@SiO2@PDA的非标记型比率荧光探针在miRNA检测中的应用，探针捕获体系中的目标单链形成DNA双链结构，由于刚性，双链远离聚多巴胺表面，游离染料SG1可以嵌进双链碱基对中发出荧光，与内部参比荧光强度形成比率，随着目标物浓度升高，SG1在530nm处的荧光越来越强，而CdTe量子点在630nm处的荧光基本保持不变，利用miRNA浓度和荧光强度的比值的关系，实现目标miRNA的高选择性和高灵敏度检测。步骤如下：
[0012](1)将表面可修饰纳米颗粒CdTe@SiO2@PDA分散在煮沸过滤的pH为7.5的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(HEPES)中，使CdTe@SiO2@PDA的分散浓度为0.3～0.5mg/ml，作为母液；向母液加入1mM的待测miRNA目标序列的互补链搅拌30分钟后，加入0.5～2mM MgCl2，控制CdTe@SiO2@PDA:miRNA:Mg
2+
的摩尔比＝1:1:0.5，搅拌过夜使互补链充分吸附于CdTe@SiO2@PDA表面；
[0013](2)上述混合体系经离心分离上清后，沉淀颗粒重新分散在煮沸过滤的pH为7.5的HEPES中，使沉淀颗粒分散浓度为0.3～0.5mg/ml，分别加入目标序列miRNA链和待测体系，37℃下孵育3小时；
[0014](3)向混合体系中加入SG1染料，充分混合后分别测定混合反应体系在530nm、
630nm处的荧光强度比值，以混合反应体系中的miRNA浓度为横坐标，混合反应体系的荧光强度比值I
630
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种带有内部荧光的表面可修饰纳米颗粒，其特征在于，该表面可修饰纳米颗粒主要由内部的CdTe量子点荧光团及其外依次包覆的二氧化硅壳层和聚多巴胺壳层三部分组成，称为CdTe@SiO2@PDA；其中CdTe量子点荧光团集中包覆在均匀的二氧化硅壳层中间，进一步包覆均匀的聚多巴胺层，构成核
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壳
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壳结构；所述的核
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壳
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壳结构纳米颗粒的粒径为120～180nm；所述的核
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壳结构纳米颗粒粒径为100～160nm，二氧化硅层厚度为50～80nm。2.一种权利要求1所述的表面可修饰纳米颗粒作为非标记型比率荧光探针在miRNA检测中的应用，其特征在于，步骤如下：(1)将表面可修饰纳米颗粒CdTe@SiO2@PDA分散在煮沸过滤的pH为7.5的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中，使CdTe@SiO2@PDA的分散浓度为0.3～0.5mg/ml，作为母液；向母液加入1mM的待测miRNA目标序列的互补链搅拌30分钟后，加入0...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴硕，林晓桐，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：