一种新型氯胺酮快速定性筛查和准确定量分析方法技术

本发明专利技术公开一种新型氯胺酮快速定性筛查和准确定量分析方法，采用氯胺酮半抗原包被微孔板的竞争模式可快速对人体血液、尿液以及环境样品中的KET进行定量分析。该方法获得的竞争定量方程，其线性相关系数为0.992，线性范围是0.01μg/mL~0.5μg/mL，检出限为0.1 pg/ml，特异性结果表明干扰物的交叉反应率均低于10%。低、中、高浓度加标样品的回收率为96%~117%。本法与经典的GC

【技术实现步骤摘要】
一种新型氯胺酮快速定性筛查和准确定量分析方法


[0001]本专利技术属于KET检测
，尤其涉及一种新型氯胺酮快速定性筛查和准确定量分析方法。

技术介绍

[0002]由于氯胺酮（本专利技术简称KET）定性定量分析使用的广泛性、重要性和急迫性，近年来研究者几乎已使用了所有已知分析方法，而且新的分析方法还不断涌现。传统上，色谱、质谱(MS)以及两者联用的方法被视为成瘾药物分析的金标准，包括：气相色谱(GC)[1
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4]、液相色谱(LC)[4
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6]、GC
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质谱联用法（包括单四级杆气相色谱质谱联用法GC
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MS和串联四级杆气相色谱质谱联用法(GC
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MS/MS)[7, 8]、LC
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质谱联用法[9
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12]、质谱法[13, 14]。尽管这些技术具有优良的准确性和灵敏度，但也存在一些缺点，包括不够便携，测试时间长，涉及繁琐和溶剂消耗的样品制备步骤，需要熟练的操作者，运行和维护费用昂贵，不适于现场分析。其它常用方法还有：毛细管电泳法[15, 16]、荧光免疫法[17, 18]、电化学方法[19, 20]、表面等离子体共振(SPR)[21]、拉曼光谱法[22
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24]、红外光谱（IR）法[25
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28]等。其中，毛细管电泳法分离效率高，但其具有与色谱法同样的缺点。电化学方法简单，成本低，可实现现场检测。但其抗干扰能力差对检测体系要求高，电极修饰较复杂，稳定性重现性较差。SPR法具有快速响应的优点，灵敏度和特异性高，不需要复杂的样品制备。但需要特殊仪器，对检测体系要求高，技术性强。拉曼光谱和IR技术简单、快速、灵敏度高、可无损检测，但是拉曼光谱往往具有强烈的荧光背景，应采用衬底材料制成表面增强拉曼光谱，然而仍需仔细、有侵入性的样品制备，因此不适合常规分析。IR技术对缴获的固体合成毒品分析简单快速，但是对于复杂基质的液体样品，由于基质背景干扰严重分析困难。总之在众多分析方法中，荧光免疫分析法由于其灵敏度高、简单、快速、易于使用、便携、一次性等优点，已成为成瘾药物测定方面的新热点[17, 18, 29
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32]。
[0003]本文采用竞争的新思路构建CFIA方法，获得KET特异性分析的新平台。在氯胺酮抗体（KET
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Ab）上标记异硫氰酸荧光素(FITC)作为结果信号分子。样品溶液中的KET作为抗原（KET
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Ag）与微孔板上包被的氯胺酮半抗原（KET
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BSA）相互竞争，与FITC标记的KET
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Ab结合。荧光强度与KET浓度负相关，KET定量方程的线性相关系数大于0.992%。采用GC
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MS/MS法和CFIA法对KET的LOD值分别进行测定，发现CFIA法对KET的LOD值低1
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104倍，而且此两种方法同时用于KET实际样品检测时，获得定量结果的相对偏差小于10%。综上，KET分析新方法，即：CFIA法，被成功建立。该方法简单、灵敏，便携、无需复杂的样品前处理，可进行大量生物样品和环境样品的定性筛查，以及快速定量分析。CFIA法还可被进一步推广应用到其它成瘾药物，以及多种混合成瘾药物的简单、快速定性筛查和准确定量分析中。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提出了一种灵敏的间接竞争荧光免疫定量KET检测法。
[0005]本专利技术的目的是这样实现的，一种新型氯胺酮（KET）快速定性筛查和准确定量分析方法，包括如下步骤：第一步，缓慢将氯胺酮半抗原（KET
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BSA）溶液滴加到微孔板的每个微孔中，包被过夜，然后用PBST洗涤，备用；第二步，用OVA溶液封闭KET
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BSA中的非特异性结合位点，再用PBST洗涤；第三步，氯胺酮单克隆抗体（KET
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Ab）用荧光染料标记；将荧光染料标记的KET
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Ab，与待测样品溶液或各种KET标准溶液中的氯胺酮抗原（KET
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Ag），进行混合，得到混合液，把上述的混合液再分别加入微孔板不同的微孔中；然后进行KET
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Ag/KET
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Ab孵育；孵育完成后再用PBST洗涤；第四步，将孵育并洗涤完成后的微孔板在酶标仪上分别测定每个微孔的荧光强度值，通过记录KET的相对荧光强度值来定性定量检测KET。
[0006]上述KET
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Ab标记染料为FITC，KET
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BSA包被微孔板的最佳浓度为50 μg/ml，包被最佳条件为4℃下12 h；抗原抗体（KET
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Ag/KET
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Ab）反应的最佳条件为37℃下反应2h；KET
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Ag/KET
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Ab反应时PBS缓冲液最佳pH值为中性，PBS缓冲液中最佳磷酸盐浓度为0.01 mol/L。
[0007]在上述第三步中，要在具有高度特异性的KET
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Ab上标记荧光染料作为信号分子，而且制备的KET
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Ab应具有高度的KET识别专一性，对基质复杂样品中的其它结构类似的干扰药物的交叉反应率应尽量低，这样才能保证KET定性定量结果的准确性。因此该高度特异的KET
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Ab制备流程为：第一步，小鼠免疫；第二步，淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合；第三步，杂交瘤细胞的筛查；第四步，KET
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Ab的纯化。
[0008]本专利技术采用上述的一种新型KET快速定性筛查和准确定量分析方法，其特征在于：能对KET进行高特异性识别和分析。
[0009]本专利技术具有如下特点和优点：本专利技术采用KET
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BSA包被微孔板并与待测样品中的KET
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Ag竞争结合FITC标记KET
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Ab的新型模式，间接快速对人体尿液、血液和环境样品中的KET进行定量分析。该方法中，样品的KET含量与检测到的荧光强度负相关。最终获得的竞争定量方程线性相关系数为0.992，线性范围是0.01 μg/mL~0.5 μg/mL，LOD为0.1 pg/ml，方法特异性结果表明去甲氯胺酮的交叉反应率低于10%。在加标样品检测中回收率在96%至104%之间。CFIA法与GC
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MS/MS法同时用于KET实际样品检测时，获得定量结果的相对偏差小于10%。采用GC
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MS/MS法和CFIA法对KET的LOD值分别进行测定，发现CFIA法对KET的LOD值低1
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104倍，而且样品前处理以及经济投入方面都较经典的气质联用法有很大优势。总之，该方法可作为临床血液、尿液样本或者环境水样品中KET的快速灵敏初筛以及定量的新思路。
附图说明
[0010]图1为本专利技术KET
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BSA合成路线图。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型氯胺酮（KET）快速定性筛查和准确定量分析方法，包括如下步骤：第一步，缓慢将氯胺酮半抗原（KET
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BSA）溶液滴加到微孔板的每个微孔中，包被过夜，然后用PBST洗涤，备用；第二步，用OVA溶液封闭KET
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BSA中的非特异性结合位点，再用PBST洗涤；第三步，氯胺酮单克隆抗体（KET
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Ab）用荧光染料标记；将荧光染料标记的KET
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Ab，与待测样品溶液或各种KET标准溶液中的氯胺酮抗原（KET
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Ag），进行混合，得到混合液，把上述的混合液再分别加入微孔板不同的微孔中；然后进行KET
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Ag/KET
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Ab孵育；孵育完成后再用PBST洗涤；第四步，将孵育并洗涤完成后的微孔板在酶标仪上分别测定每个微孔的荧光强度值，通过记录KET的相对荧光强度值来定性定量检测KET。2.根据权利要求1所述的一种新型KET快速定性筛查和准确定量分析方法，其特征在于：KET
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Ab标记染料为FITC，KET
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BSA包被微孔板的最佳浓度为5...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹洁，陈小英，
申请(专利权)人：福建警察学院，
类型：发明
国别省市：