Au@Pd核壳八面体纳米酶双信号放大SPR检测探针制备方法技术

本发明专利技术公开了一种Au@Pd核壳八面体纳米酶双信号放大SPR检测探针制备方法，先合成Au@Pd核壳八面体纳米酶，利用Pd与氨基的牢固结合的特点直接将二级抗体固定于其表面得到双信号放大探针，通过在表面等离子体共振分析仪的芯片表面修饰金黄色葡萄糖球菌蛋白以固定一级抗体，用牛血清蛋白封闭再结合抗原，进一步结合探针，SPR信号放大，再通入苯胺和H2O2的混合溶液，利用纳米酶在SPR芯片表面催化苯胺的聚合反应达到二次信号放大目的。当SPR检测探针捕获待检测抗原分子后，具有过氧化物酶模拟酶性质的Au@Pd核壳八面体纳米酶，可在SPR芯片表面催化苯胺聚合生成聚苯胺，从而形成二次SPR信号放大，可用于高灵敏的SPR免疫传感器检测疾病标志物等生物分子。疾病标志物等生物分子。疾病标志物等生物分子。

Au@Pd Preparation of core-shell octahedral nano enzyme double signal amplified SPR detection probe

【技术实现步骤摘要】
Au@Pd核壳八面体纳米酶双信号放大SPR检测探针制备方法


[0001]本专利技术属于免疫学领域和电化学分析
，更具体地说，本专利技术涉及一种Au@Pd核壳八面体纳米酶双信号放大表面等离子共振(SPR)检测探针的制备方法。

技术介绍

[0002]表面等离子体共振传感是基于表面等离子体共振这一光学现象发展的。Liedberg等人于1983年发现金属表面附近的质量累积会影响金属与电介质交界面的折射率，而SPR信号对折射率变化很敏感，首次开发了表面等离子体共振传感器研究结合反应。SPR传感器为研究分子结合提供了一种快速、实时、高选择性和高灵敏性的测定方法。SPR可在分子水平上分析生物及药物分子之间的相互作用，如：蛋白质、DNA、脂质到小分子、噬菌体及病毒等，SPR传感器都可以研究其相互作用而应用于临床医学、药物筛选、食品安全及环境检测领域。SPR传感器电化学分析技术和免疫检测技术相结合，因制作简单、损耗小及高选择性和实时性等优点而备受关注。
[0003]夹心免疫分析是利用抗体与待测抗原发生特异性结合时，根据待测物浓度对SPR信号变化的影响关系实现免疫检测。相对于传统的修饰基底以增大SPR信号的方法，本专利技术的方法可进行二次信号放大近而提高检测灵敏度。
[0004]用于增大SPR信号的材料有聚合物和纳米材料。目前，应用于SPR传感器的纳米材料包括磁性纳米材料、碳纳米材料和贵金属纳米材料。其中，贵金属纳米材料中金、钯纳米粒子具有优异的光学及电学性质，通过与SPR金膜之间的电磁耦合的综合作用导致较大的SPR信号变化。由于核壳纳米材料的特殊结构，具有现出优异的高比表面积、良好的生物相容性、稳定的光学性质。纳米模拟酶融合了化学催化剂与生物催化剂的独特优势。与天然酶相比，纳米酶具有低成本，高稳定性，高耐受性，可长期储存，易于大规模生产及活性可调控等优势。相比单金属，具有核壳结构的双金属具有更优良的模拟酶催化性能，而被用于生物传感，疾病诊断治疗方面。本专利技术将Ag和Pd复合后得到Au@Pd核壳八面体纳米酶，基于该复合纳米材料的优良性能，可以很好的应用在生物传感器领域，尚未有Au@Pd核壳八面体纳米酶用于表面等离子免疫传感领域的报道。苯胺在催化过氧化氢的作用下可以生成聚苯胺，可以二次信号放大以提高灵敏度。

技术实现思路

[0005]为了克服上述缺陷，本专利技术提供一种Au@Pd核壳八面体纳米酶双信号放大表面等离子体共振(SPR)检测探针的制备，其基本思路为：先合成Au@Pd核壳八面体纳米酶，利用Pd与氨基的牢固结合的特点直接将二级抗体(Ab2)固定于其表面得到双信号放大探针(Au@Pd
‑
Ab2)，通过在表面等离子体共振分析仪的芯片表面修饰金黄色葡萄糖球菌蛋白以固定一级抗体(Ab1)，用牛血清蛋白封闭再结合抗原，进一步结合探针，SPR信号放大，再通入苯胺和H2O2的混合溶液，利用纳米酶在SPR芯片表面催化苯胺的聚合反应达到二次信号放大目的。利用SPR信号变化与抗原浓度之间的线性关系，可用于高灵敏的SPR免疫传感器检测蛋
白质分子。
[0006]合成Au@Pd核壳八面体纳米酶：
[0007]在烧杯中加入氯金酸溶液、氯钯酸钾溶液和超纯水超声混合后，接着加入十六烷基三甲基氯化铵溶液，混合均匀得到混合溶液(摩尔比为：氯金酸：氯钯酸钾：十六烷基三甲基氯化铵＝4：12：3)。将混合溶液转入反应釜中，接着将反应釜放入鼓风干燥箱中，设置温度为90℃，反应48h。待反应结束冷却至室温，离心洗涤收集得到Au@Pd核壳八面体，并再次分散于超纯水中备用。Au@Pd核壳八面体平均粒径为60nm。
[0008]具体采用如下的技术方案：
[0009]一种Au@Pd核壳八面体纳米酶双信号放大SPR检测探针制备方法，以氯金酸为金源，氯钯酸钾为钯源，超纯水作为溶剂，以十六烷基三甲基氯化铵为还原剂和稳定剂，采用一步水热法合成Au@Pd核壳八面体纳米酶，利用Au@Pd核壳八面体纳米酶固定二级抗体Ab2制得SPR检测探针。
[0010]具体包括以下步骤：
[0011](1)将Au@Pd核壳八面体纳米酶超声分散于磷酸缓冲溶液PBS中，加入二级抗体Ab2，低温下搅拌，再通过低温高速离心，继续分散于PBS中，低温储藏；
[0012](2)将H2O2、氨水和超纯水的混合溶液煮至微沸，将表面等离子共振SPR芯片放入浸泡，接着用超纯水和乙醇交替冲洗SPR芯片，再用氮气吹干；
[0013](3)将步骤(2)中处理好的芯片装入表面等离子体共振检测池中；将PBS通入检测池以平稳基线；
[0014](4)在步骤(3)基线平稳后，注入金黄色葡萄球菌蛋白SPA溶液，待信号平稳，注入PBS冲洗至SPR信号稳定；
[0015](5)在步骤(4)中SPR信号稳定后注入一级抗体Ab1与SPA反应，待信号平稳，再通入PBS冲洗至SPR信号稳定；
[0016](6)在步骤(5)中SPR信号稳定后注入牛血清蛋白溶液进行封闭，待信号平稳，再通入PBS冲洗至SPR信号稳定；
[0017](7)在步骤(6)中SPR信号稳定后注入抗原与一级抗体Ab1反应，待信号平稳，再通入PBS冲洗至SPR信号稳定；
[0018](8)在步骤(7)中SPR信号稳定后注入Au@Pd
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Ab2与抗原反应，待信号平稳，再通入PBS冲洗至SPR信号稳定；
[0019](9)在步骤(8)中SPR信号稳定后注入苯胺和H2O2的混合溶液，待信号平稳，再通入PBS冲洗至SPR信号稳定。
[0020]优选的，步骤(1)中，所述Au@Pd核壳八面体纳米酶的浓度为0.5
‑
2mg/mL，二级抗体Ab2的浓度为1mg/mL；所述低温为4℃，离心转速及时间为10000r/min和30min。
[0021]优选的，步骤(2)中，所述H2O2、氨水和超纯水的混合溶液的混合体积比为1：1：5。
[0022]优选的，步骤(3)～步骤(9)中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01M；步骤(4)中，所述SPA的浓度为100μg/mL。
[0023]优选的，步骤(5)中，所述Ab1浓度为100μg/mL；步骤(6)中，所述牛血清蛋白溶液浓度为200μg/mL。
[0024]优选的，步骤(7)中，所述抗原浓度为0.005～1μg/mL。
[0025]优选的，步骤(8)中，所述Au@Pd
‑
Ab2浓度为10μg/mL。
[0026]优选的，步骤(9)中，所述苯胺和H2O2的混合溶液中苯胺的浓度为30mM，H2O2的浓度为5mM。
[0027]优选的，步骤(2)～(9)中，通入流速为5μL/min，温育时间为30min。
[0028]本专利技术至少包括以下有益效果：
[0029](1)本专利技术使用的材料为Au@Pd核壳八面体纳米酶，一方面Au@Pd核壳八面体纳米酶具有高比表面积和优异的光学及电学性质等优点，且Pd可与氨基牢固结合直接能固本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Au@Pd核壳八面体纳米酶双信号放大SPR检测探针制备方法，其特征在于，以氯金酸为金源，氯钯酸钾为钯源，超纯水作为溶剂，以十六烷基三甲基氯化铵为还原剂和稳定剂，采用一步水热法合成Au@Pd核壳八面体纳米酶，利用Au@Pd核壳八面体纳米酶固定二级抗体Ab2制得SPR检测探针。2.根据权利要求1所述的Au@Pd核壳八面体纳米酶双信号放大SPR检测探针制备方法，其特征在于，利用Au@Pd核壳八面体纳米酶固定二级抗体Ab2制得SPR检测探针，包括以下步骤：(1)将Au@Pd核壳八面体纳米酶超声分散于磷酸缓冲溶液PBS中，加入二级抗体Ab2，低温下搅拌，再通过低温高速离心，继续分散于PBS中，低温储藏；(2)将H2O2、氨水和超纯水的混合溶液煮至微沸，将表面等离子共振SPR芯片放入浸泡，接着用超纯水和乙醇交替冲洗SPR芯片，再用氮气吹干；(3)将步骤(2)中处理好的芯片装入表面等离子体共振检测池中；将PBS通入检测池以平稳基线；(4)在步骤(3)基线平稳后，注入金黄色葡萄球菌蛋白SPA溶液，待信号平稳，注入PBS冲洗至SPR信号稳定；(5)在步骤(4)中SPR信号稳定后注入一级抗体Ab1与SPA反应，待信号平稳，再通入PBS冲洗至SPR信号稳定；(6)在步骤(5)中SPR信号稳定后注入牛血清蛋白溶液进行封闭，待信号平稳，再通入PBS冲洗至SPR信号稳定；(7)在步骤(6)中SPR信号稳定后注入抗原与一级抗体Ab1反应，待信号平稳，再通入PBS冲洗至SPR信号稳定；(8)在步骤(7)中SPR信号稳定后注入Au@Pd
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Ab2与抗原反应，待信号平稳，再通入PBS冲洗至SPR信号稳定；(9)在步骤(8)中SPR信号稳定后注入苯胺和H2O2的混合溶液，待信号平稳，再通入PBS冲洗至SPR信号稳定。3.根据权利要求2所述的Au...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨占军，李娟，石凤，夏艳平，
申请(专利权)人：宿迁市智芯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：