一种蛋白质组学标准品及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种蛋白质组学标准品及其制备方法，具体还公开了相应的试剂盒和蛋白质组学标准品细胞株筛选的方法。本发明专利技术所提供的标准品具有代次间稳定，多次传代后，蛋白质组的定量稳健，应用本发明专利技术的标准品能够有效的提高蛋白质组学定量的准确性。高蛋白质组学定量的准确性。高蛋白质组学定量的准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白质组学标准品及其制备方法


[0001]本专利技术属于蛋白质组学领域，具体涉及一种蛋白质组学标准品及其制备方法。

技术介绍

[0002]近年来，随着生命组学研究包括基因组学、转录组学、翻译组学和蛋白质组学的快速发展以及生物信息与大数据科学交叉应用的推动下，孕育了一种新型医学概念和医疗模式，即精准医疗。
[0003]生命组学研究是揭示疾病机制和精准医疗最重要的手段之一，组学的数据质量直接关乎疾病机制的准确性和精准医疗的有效性。然而，目前的组学数据因各实验室选择的标准品没有统一，同时样品处理方式多样，测定平台多样化以及分析技术不精准，导致跨平台和跨实验室数据的重复性和实验性差。人类通用参考RNA标准品(Universal Human Reference RNA,UHRR)是包括HeLa在内的10种癌细胞系的混合RNA，其不稳定性是众所周知的。实际上，在UHRR批次间比较中，Pearson相关性仅达到R2＝0.9478，这表明即使在短生产周期内也存在这种不稳定性。这种变异预计在长生产周期内会成倍增加，不足以评估随着深度和分辨率的增加而不断发展的下一代测序技术的再现性。以往被用于标准品的Hela细胞因其存在超强的种内污染和种间污染而存在广泛争论。有研究表明，将不同实验室使用的Hela细胞系集中培养并连续传代50个代次，利用目前最新的定量蛋白质组学和其他组学技术，结合分子细胞学实验，发现相同命名的Hela细胞在表型和各分子层次上存在着显著的生物学变异。因此，选择在多组学层次上稳健性一致性的标准品是保障组数数据稳定产出的关键。

技术实现思路

[0004]本专利技术通过实例提供一种蛋白质组学标准品及其制备方法以解决现有标准品代次间不稳定的问题，为蛋白质组学的发展提供了一种稳定的标准品。
[0005]为了实现上述的目的，本专利技术按照如下技术方案进行实施：
[0006]一种蛋白质组学标准品，所述标准品为从MHCC97H细胞株中提取获得的细胞全蛋白质或由细胞全蛋白质水解得到的多肽。
[0007]优选地，所述的蛋白质组标准品由以下方法制备而成：步骤一、培养MHCC97H细胞；步骤二、从MHCC97H细胞中提取获得总蛋白质。
[0008]优选地，所述的方法还包括步骤三；具体为：将步骤二所获得的总蛋白质进行水解获得多肽。
[0009]本专利技术还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包含有权利要求1
‑
3任一项所述的蛋白质组学标准品。
[0010]本专利技术提供了一种蛋白质组学标准品的制备方法；包括以下步骤：
[0011]步骤一、培养MHCC97H细胞；
[0012]步骤二、从MHCC97H细胞中提取获得总蛋白质。
[0013]优选地，步骤二的具体为：
[0014]1.融解SDS裂解液，混匀；取适当量的裂解液，在使用前加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM；
[0015]2.去除细胞培养液，用PBS洗一遍；
[0016]3.根据细胞数量，按每一百万细胞加入150
‑
250微升SDS裂解液的比例加入SDS裂解液；用移液枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触；
[0017]4.将样品置于冰上裂解30min；每隔10分钟涡旋震荡15秒；
[0018]5.17000
×
g，4℃，离心30分钟，吸取上清液为蛋白质组学标准品；置于
‑
80
°
冰箱保存。
[0019]优选地，还包括步骤三；所述步骤三的具体操作为：将步骤二所获得的总蛋白质进行滤器辅助样品制备法酶解获得多肽；具体的为：
[0020]1、向每管200微克总蛋白质样品中加入蛋白变性剂尿素，并使尿素终浓度大于6M，此时若液体有可见沉淀,可使用超声仪处理20s，每隔5s暂停一次；
[0021]2、加入50mM的DTT，置于37℃水浴锅1h；
[0022]3、加入100mM的IAA，室温静置30min；
[0023]4、将经过还原和烷基化的蛋白质样品转移至30kDa的超滤管中，4℃，12000
×
g离心20min；
[0024]5、加入100μL 8M尿素，4℃，12000
×
g离心20min，重复此步骤一次；
[0025]6、加入100μL 50mM TEAB，4℃，12000
×
g离心20min，重复此步骤四次；
[0026]7、加入50μL 50mM TEAB后，再加入胰酶，其中蛋白质的量与胰酶的量的比例为30:1；
[0027]8、将超滤管置于干净套管中，用封口膜密封管口，放置37℃恒温箱中孵育12h；
[0028]9、4℃下12000
×
g离心20min收集肽段获得多肽形态的蛋白质组学标准品。
[0029]本专利技术还提供了一种蛋白质组学标准品细胞株的筛选方法；包括以下步骤：
[0030]步骤一、培养待筛选的目标细胞；具体为：使用含10％胎牛血清，1％双抗，0.5％环丙沙星的DMEM完全培养基培养细胞，细胞长至90％密度进行胰酶消化传代，连续采集8～10个代次细胞，每次分别采集8
×
106细胞数备用；
[0031]步骤二、从所获的各代次细胞中分别提取获得总蛋白质；具体步骤为：
[0032]1.融解SDS裂解液，混匀；取适当量的裂解液，在使用前加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM；
[0033]2.去除细胞培养液，用PBS洗一遍；
[0034]3.根据细胞数量，按每一百万细胞加入150
‑
250微升SDS裂解液的比例加入SDS裂解液；用移液枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触；
[0035]4.将样品置于冰上裂解30min；每隔10分钟涡旋震荡15秒；
[0036]5.17000
×
g，4℃，离心30分钟，吸取上清液为总蛋白质样品；置于
‑
80
°
冰箱保存；
[0037]步骤三、将步骤二所获得的总蛋白质进行滤器辅助样品制备法酶解获得多肽；具体操作为：
[0038]1、向每管200微克总蛋白质样品中加入蛋白变性剂尿素，并使尿素终浓度大于6M，此时若液体有可见沉淀,可使用超声仪处理20s，每隔5s暂停一次；
[0039]2、加入50mM的DTT，置于37℃水浴锅1h；
[0040]3、加入100mM的IAA，室温静置30min；
[0041]4、将经过还原和烷基化的蛋白质样品转移至30kDa的超滤管中，4℃，12000
×
g离心20min；
[0042]5、加入100μL8M尿素，4℃，12000
×
g离心20min，重复此步骤一次；
[0043]6、加入100μL50mMTEAB，4℃，12000
×
g离心20min，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质组学标准品，其特征在于：所述标准品为从MHCC97H细胞株中提取获得的细胞全蛋白质或由MHCC97H细胞全蛋白质水解得到的多肽。2.如权利要求1所述的蛋白质组学标准品；其特征在于：所述的蛋白质组标准品由以下方法制备而成：步骤一、培养MHCC97H细胞；步骤二、从MHCC97H细胞中提取获得总蛋白质。3.如权利要求2所述的蛋白质组学标准品；其特征在于：所述的方法还包括步骤三；具体为：将步骤二所获得的总蛋白质进行水解获得多肽。4.一种试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包含有权利要求1
‑
3任一项所述的蛋白质组学标准品。5.一种如权利要求1
‑
3任一项所述的蛋白质组学标准品的制备方法；其特征在于包括以下步骤：步骤一、培养MHCC97H细胞；步骤二、从MHCC97H细胞中提取获得总蛋白质。6.如权利要求5所述的蛋白质组学标准品的制备方法；其特征在于：步骤二的具体操作为：1.融解SDS裂解液，混匀；取适当量的裂解液，在使用前加入PMSF，使PMSF的至最终浓度为1mM；2.去除细胞培养液，用PBS洗一遍；3.根据细胞数量，按每一百万细胞加入150
‑
250微升SDS裂解液的比例加入SDS裂解液；用移液枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触；4.将样品置于冰上裂解30min；每隔10分钟涡旋震荡15秒；5.17000
×
g，4℃，离心30分钟，吸取上清液为蛋白质组学标准品；置于
‑
80
°
冰箱保存。7.如权利要求5所述的蛋白质组学标准品的制备方法；其特征在于：还包括步骤三；所述步骤三的具体操作为：将步骤二所获得的总蛋白质进行滤器辅助样品制备法酶解获得多肽；具体的为：1、向每管200微克总蛋白质样品中加入蛋白变性剂尿素，并使尿素终浓度大于6M，此时若液体有可见沉淀,可使用超声仪处理20s，每隔5s暂停一次；2、加入50mM的DTT，置于37℃水浴锅1h；3、加入100mM的IAA，室温静置30min；4、将经过还原和烷基化的蛋白质样品转移至30kDa的超滤管中，4℃，12000
×
g离心20min；5、加入100μL 8M尿素，4℃，12000
×
g离心20min，重复此步骤一次；6、加入100μL 50mM TEAB，4℃，12000
×
g离心20min，重复此步骤四次；7、加入50μL 50mM TEAB后，再加入胰酶，其中蛋白质的量与胰酶的量的比例为30:1；8、将超滤管置于干净套管中，用封口膜密封管口，放置37℃恒温...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢少华，陈洋，张弓，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：