一株微杆菌及其修复铬污染土壤的微生物还原方法技术

本发明专利技术提供一株微杆菌，该微杆菌的分类命名为：Microbacterium sp.GRINML SWG1，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2021年8月6日，保藏编号：CCTCC NO：M2021992。本发明专利技术提供的微杆菌可以高效还原不同浓度的可溶性六价铬，为微生物还原技术应用于铬污染土壤修复提供实验技术和理论依据。和理论依据。和理论依据。

【技术实现步骤摘要】
一株微杆菌及其修复铬污染土壤的微生物还原方法


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一株微杆菌及其原位修复铬污染土壤的微生物还原方法。

技术介绍

[0002]我国为铬盐化工生产大国，造成了铬渣堆放和铬盐厂遗留场地铬污染严重。再加上我国地域辽阔，场地土质和地下水特征差异显著，使得不同场地铬污染物迁移转化规律复杂多样。在铬污染场地修复方面，目前绝大部分修复工程采用固化/稳定化和阻隔填埋技术，传统修复技术远不能满足铬污染场地污染防治需求。相较于传统的修复技术，微生物修复技术具有安全性、非破坏性和经济性等优点。微生物修复技术是指即利用土著微生物或驯化后的工程菌还原固化土壤中的六价铬。在受污染的土壤中构建健康的微生物生态系统，该生态系统中的微生物可以通过自我平衡、自我生长，吸收土壤中养分并分泌胞外聚合物粘附含铬离子，将高毒性的六价铬还原固化成低毒性的化合物沉淀，从而实现六价铬还原、改善生态系统、促进植物根系生长，达到修复土壤铬污染的目的。因此采用微生物技术修复铬污染场地是近年来国内外广泛关注的热点领域。

技术实现思路

[0003]为了解决上述问题，本专利技术的第一个目的在于提供一种耐重金属铬的微杆菌，该菌种可在好氧条件下高效还原可溶性高毒性六价铬为低毒性三价铬。
[0004]本专利技术的第二个目的在于提供一种可以分离该细菌的培养基。
[0005]本专利技术的第三个目的在于提供一种可以驯化培养该细菌的培养基。
[0006]本专利技术的第四个目的在于提供一种利用该菌原位修复铬污染土壤的方法。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供一种微杆菌，该微杆菌的分类命名为：Microbacterium sp.GRINML SWG1，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2021年8月6日，保藏编号为：CCTCC NO：M2021992。
[0008]上述微杆菌菌落呈圆形，棕黄色半透明，表面光滑，湿润，边缘规则，中央微凸起。
[0009]本专利技术还提供了用于分离如上述所述微杆菌的培养基，该培养基的配方为：酵母提取液5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，K2Cr2O
7 100mg/L，pH为7～8，琼脂粉15～30g/L。
[0010]本专利技术还提供了用于驯化培养如上所述微杆菌的培养基，该培养基配方为：葡萄糖4.0g/L，玉米浆干粉5.0g/L，Na2HPO
4 3.0～6.0g/L，KH2PO
4 3.0g/L，NaCl0.5g/L，MgSO4.7H2O 0.246g/L，CaCl
2 0.5g/L，K2Cr2O
7 300～1000mg/L，pH为7～8。该培养基相比LB培养基，配方中的碳氮源更为廉价、效果相对高效。
[0011]该培养基的制备方法为：将不添加K2Cr2O7的其它培养基成分按比例混合，调节pH至7～8，121℃下灭菌30分钟，然后再添加经过紫外光线灭菌的固体K2Cr2O
7 0.849g/L～2.829g/L，后加K2Cr2O7是避免K2Cr2O7被高温破坏。
10.0g/L，K2Cr2O
7 100mg/L，pH为7，琼脂粉20g/L。
[0032]用于驯化培养上述微杆菌的培养基配方为：葡萄糖4.0g/L，玉米浆干粉5.0g/L，Na2HPO
4 3.0g/L，KH2PO
4 3.0g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4.7H2O 0.246g/L，CaCl
2 0.5g/L，K2Cr2O
7 300mg/L～1000mg/L，pH为7。
[0033]该驯化培养基的制备方法为：将不添加K2Cr2O7的其它培养基成分按比例混合，调节pH至7～8，121℃下灭菌30分钟，然后再添加经过紫外光线灭菌的固体K2Cr2O
7 0.849g/L～2.829g/L，后加K2Cr2O7是避免K2Cr2O7被高温破坏。
[0034]实施例1铬还原细菌微杆菌的分离
[0035]1)将5g的铬污染场地土样添加至95mL的去离子水中，置于30℃、100rpm的摇床条件下震荡15分钟后，取出静止30分钟，收集上清液；
[0036]2)取1mL上述上清液加入9mL不含琼脂粉的分离培养基中，置于30℃、150rpm的摇床条件下培养7天；
[0037]3)取1mL上述培养后的菌液加入9mL无菌水中，摇匀，得到10
‑1梯度稀释液，按梯度依次稀释10
‑2至10
‑5于分离培养基平板上均匀涂布，30℃下倒置培养7天后，挑起平板上的单菌落四线三区划线培养；
[0038]4)通过多次转接与分离纯化，得到菌落特征一致的单一菌落，如图1所示。从图1可以看出，该菌落呈圆形，棕黄色半透明，表面光滑，湿润，边缘规则，中央微凸起。
[0039]对菌落提取基因组DNA，用引物27F/1492R进行PCR扩增，然后将PCR产物切胶纯化回收，用引物27F/1492R测序，将测序结果序列在NCBI上Blast比对同源性。经鉴定分析，分离得到的菌株与Microbacterium sp.亲源关系最近，确定菌株为微杆菌(Microbacterium sp.)。
[0040]本实施例中微杆菌(Microbacterium sp.)GRINML SWG1于2021年8月6日保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2021992。
[0041]实验例2铬污染土壤的微生物修复方法
[0042]修复中所用培养基的成分为：葡萄糖4.0g/L，玉米浆干粉5.0g/L，Na2HPO
4 3.0g/L，KH2PO
4 3.0g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4.7H2O 0.246g/L，CaCl
2 0.5g/L，pH为7。
[0043]修复中所用污染土采自青海海北化工厂铬污染场地，污染状况：总铬470mg/kg，六价铬430mg/kg。
[0044]1)制备150mL驯化培养基进行灭菌，挑起平板上的Microbacterium sp菌落至驯化培养基中，在30℃、150rpm条件下摇床过夜，形成活化后的GRINML SWG1菌液；
[0045]2)取5％接种量的活化后GRINML SWG1菌液添加到K2Cr2O7含量为400mg/L的驯化培养基中，在30℃、150rpm条件下培养3周后，取5％接种量的上述菌液至K2Cr2O7含量为500mg/L的驯化培养基中，在30℃、150rpm条件下培养3周后，取5％接种量的上述菌液至K2Cr2O7含量为600mg/L的驯化培养基中；
[0046]GRINML SWG1的驯化程度根据污染土壤中铬含量进行调整，当铬污染程度比较严重是，进行逐级驯化至GRINML SWG1的铬耐受程度超过污染土壤中铬含量，当污染程度较轻时，GRINML SWG1可不进行驯化制剂使用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株微杆菌，其特征在于，该微杆菌的分类命名为：Microbacterium sp.GRINML SWG1，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2021年8月6日，保藏编号为：CCTCC NO：M2021992。2.用于分离如权利要求1所述微杆菌的培养基，其特征在于，该培养基的配方为：酵母提取液5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，K2Cr2O
7 100mg/L，pH为7～8，琼脂粉15～30g/L。3.用于驯化培养如权利要求1所述微杆菌的培养基，其特征在于，该培养基的配方为：葡萄糖4.0g/L，玉米浆干粉5.0g/L，Na2HPO
4 3.0～6.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4.7H2O 0.246g/L，CaCl
2 0.5g/L，K2Cr2O
7 300mg/L～1000mg/L，pH为7～8。4.用于驯化如权利要求1所述微杆菌的方法，其特征在于，将如权利要求1所述微杆菌接种至如权利要求3所述的培养基中，在30℃、150rpm的摇床条件下，通过300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L、800mg/L、900mg/L和1000mg/L K2Cr2O7溶液逐级驯化，单级驯化时间为2～3周，直至得到高耐受性、高还原效率的铬还原细菌。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红霞，崔兴兰，钟娟，王雷，车小奎，徐政，郑其，袁学韬，
申请(专利权)人：有研工程技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：