鲤TLR4鼠抗血清的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种鲤TLR4鼠抗血清的制备方法及应用，黄河鲤TLR4鼠抗血清的制备方法包括鲤TLR4基因开放阅读框的克隆；鲤TLR4基因重组表达载体pET

【技术实现步骤摘要】
鲤TLR4鼠抗血清的制备方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种鲤Toll样受体4鼠抗血清的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]Toll基因由Nusslein
‑
Volhard及其团队于1980年在进行果蝇相关研究的过程中被发现，并为其命名。研究显示，该受体在抗细菌、真菌等病原体中发挥着不可替代的作用，并且参与转导了抗菌感染易感性信号。Toll样受体4(Toll
‑
Like Receptor 4，TLR4)是TLR家族中不可或缺的一份子，在先天性免疫中具有无可替代的地位。存在于哺乳动物体内的TLR4主要识别的受体是LPS，但TLR4并不能直接识别相应的配体，TLR4需要LBP、MD
‑
2和CD14一起协同作用才能识别LPS。由于识别LPS的唯一受体是TLR4/MD
‑
2复合物，因此TLR4首先需要与辅助受体MD
‑
2结合，形成TLR4/MD
‑
2受体复合物后才能与LPS结合。LBP是可溶性蛋白，在其结合LPS后再与CD14结合，然后CD14再将LPS转移到唯一受体TLR4/MD
‑
2复合物上进而启动下游的信号通路。
[0003]研究发现鱼类中LPS不能诱导TLR4进行表达，鱼体内也没有CD14和MD
‑
2。所以鱼体中可能存在别的受体可以识别LPS。但在草鱼中，病毒可以诱导TLR4进行表达，所以在鱼类中TLR4虽然不能识别LPS但可以识别病毒。鲤是我国主要的经济淡水鱼类，在我国具有较大的养殖规模。然而，在养殖过程中细菌性疾病已成为制约鲤养殖业进一步发展的限制因素。因此，深入研究鲤的免疫机制，有助于建立提高鲤机体免疫的方法，对鲤养殖业的健康发展具有重要意义。哺乳动物的研究中，关于Toll样受体大多是蛋白水平的检测。由于水产上缺少相应的抗体，致使在目前的探究实验中水产动物在Toll样受体的检测大部分局限于mRNA水平，限制了进一步的深入研究。
[0004]为了解决这一技术问题，从鲤中克隆获得TLR4基因，通过原核表达和免疫小鼠的方法制备鲤TLR4鼠抗血清，通过免疫组化实验，对该抗血清的特异性进行检验，并分析其在肠道中的表达情况，对进一步研究TLR4在宿主肠道中的免疫功能具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术解决的技术问题是提供了一种鲤TLR4鼠抗血清的制备方法及应用，该方法制备的鲤TLR4鼠抗血清能够用于蛋白检测的实验要求，如(荧光)免疫组化、蛋白印迹和酶联免疫吸附等，建立体外分析、研究鲤TLR4的功能以及鲤免疫荧光染色激光共聚焦显微观察，还可用于其他鲤科鱼类TLR4的检测。
[0006]本专利技术为解决上述技术问题采用如下技术方案，鲤TLR4鼠抗血清的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
[0007]步骤S1：鲤TLR4基因开放阅读框的克隆
[0008]Trizol提取鲤肠组织总RNA，经1.0wt％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，随后用M
‑
MLV反转录酶合成cDNA第一链，于
‑
80℃保存备用，根据GenBank数据库中已报道的TLR4基因
序列设计第一对特异性引物TLR4
‑
ORF
‑
F和TLR4
‑
ORF
‑
R，进行PCR扩增获得鲤TLR4基因开放阅读框片段，其中第一对特异性引物为：
[0009]上游引物TLR4
‑
ORF
‑
F的引物序列为5'
‑
ATGACTTTCTTTACTATTACTGAGA
‑
3'；
[0010]下游引物TLR4
‑
ORF
‑
R的引物序列为5'
‑
TTATTGGTTTGTAGCAATAATA
‑
3'；
[0011]步骤S2：鲤TLR4基因重组表达载体的构建
[0012]根据鲤TLR4基因ORF全长cDNA序列设计第二对特异性引物TLR4
‑
YHBD
‑
F和TLR4
‑
YHBD
‑
R，并分别在上、下游引物添加BamH I和Hind III酶切位点，再以鲤cDNA为模板，TLR4
‑
YHBD
‑
F和TLR4
‑
YHBD
‑
R分别为上、下游引物，进行PCR扩增，将PCR产物经胶回收后和pET
‑
32a(+)表达载体进行双酶切，胶回收纯化，经T4酶连接后转入克隆感受态DH5α，获得重组表达载体pET
‑
32a(+)
‑
TLR4，其中第二对特异性引物为：
[0013]上游引物的引物序列为5
′‑
CGGGATCCAGATGCCAAATCAAGCAC
‑3′
；
[0014]下游引物的引物序列为5
′‑
CCAAGCTTAGCAGCAGATGAAACAAAG
‑3′
；
[0015]其中下划线部分为酶切位点；
[0016]步骤S3：鲤TLR4重组蛋白的诱导表达、纯化及Western Blot特异性分析
[0017]将步骤S2得到的重组表达载体pET
‑
32a(+)
‑
TLR4转入表达感受态BL21(DE3)，在含有氨苄抗性的LB培养液中于37℃培养至OD值为0.5
‑
0.6时，加入IPTG进行诱导培养，经离心收集菌体、PBS重悬后加入5
×
上样缓冲液沸水浴10min，经12wt％SDS
‑
PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况，并做相应的对照组；
[0018]以1wt％的接种量将能表达重组蛋白的菌液添加到含有氨苄抗性的LB培养基中，扩大培养，于37℃培养至OD值为0.5
‑
0.6时，加入IPTG进行诱导培养，将诱导培养好的菌液离心，收集菌体用变性结合缓冲液重悬浮后采用超声波破碎的方法获得融合蛋白的包涵体，借助变性洗脱缓冲液通过His Trap HP柱对融合蛋白进行纯化，并用透析方法去除融合蛋白溶液中的CH4N2O和C3H4N2盐离子，获得纯化的鲤TLR4重组蛋白；
[0019]步骤S4：鲤TLR4鼠抗血清的制备
[0020]将步骤S3纯化的鲤TLR4重组蛋白作为抗原，蛋白质浓度用0.85wt％的生理盐水调整为500μg/mL后对小鼠进行5次免疫，按体积比1:1的比例加入弗氏佐剂，初次免疫选用复试完全佐剂，采用腹部皮下多点注射，随后每隔1周加强免疫1次，共免疫5次，加强免疫选用弗氏不完全佐剂，末次免疫10天后进行全血分离，收集鼠抗血清，纯化得到鲤TLR4鼠抗血清。
[0021]进一步限定，步骤S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
TaqTM 12.5μL、TLR4
‑
YHBD
‑
F 1.0μL、TLR4
‑
YHBD
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R 1.0μL和cDNA 1.0μL；所述第二对特异性引物进行PCR扩增时的反应条件为：95℃预变性5min；35次循环中包括94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min。4.根据权利要求1所述的鲤TLR4鼠抗血清的制备方法，其特征在于：步骤S3中加入IPTG进行诱导培养时，IPTG的添加时间点为大肠杆菌BL21(DE3)进入指数生长期时及菌液的OD
600nm
达到0.5
‑
0.6时；IPTG的终浓度为1mmol/L，IPTG的诱导时间为6h；...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯军厂，王先锋，宋东蓥，常绪路，张建新，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：