蛋白抑制剂及其应用制造技术

一类Legumain蛋白抑制剂及其应用，其结构式为该抑制剂能够特异性抑制肿瘤细胞中高表达的Legumain蛋白，通过与Legumain蛋白的结合域结合，抑制其活性并降低蛋白表达，从而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，并诱导降低肿瘤细胞对化疗的耐受能力，具有特异性好，生物利用度高，无肝肾毒副作用等特点，可用于治疗乳腺癌，其作用机制明确，能有效抑制肿瘤的转移和侵袭。能有效抑制肿瘤的转移和侵袭。能有效抑制肿瘤的转移和侵袭。

【技术实现步骤摘要】
蛋白抑制剂及其应用


[0001]本专利技术涉及的是一种医药领域的技术，具体是一类小分子天冬酰胺内肽酶(Legumain) 蛋白抑制剂及其应用

技术介绍

[0002]天冬酰胺内肽酶(又称AEP)是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，其结构相当保守，是目前已知的哺乳动物体内唯一的天冬酰胺内肽酶，可特异性水解天冬氨酸肽键，在细胞内发挥剪切蛋白与信号转导的作用，与抗原呈递、肿瘤、阿尔兹海默症、肝损伤、肾损伤等病理生理过程密切相关，对Legumain在肿瘤中的机制研究显示，其具有对肿瘤中的重要通路PI3K
‑ꢀ
AKT
‑
mTOR的调节作用，Legumain高表达时会上调这一通路的表达，从而减少细胞粘附，抑制细胞凋亡，增强肿瘤细胞抗化疗能力加强肿瘤生长，促进肿瘤血管生成和调节上皮
‑
间质转化(EMT)来促进乳腺癌的侵袭和转移。除这一通路外，Legumain还通过对NF
‑
κB通路、Erk 通路等的调控作用发挥促进肿瘤生长的作用。免疫组化实验显示Legumain在包括乳腺癌在内的多种癌种中高表达，其在肿瘤内部的高表达被认为和不良预后，临床分期等高度相关。因此Legumain有望成为新的肿瘤靶向治疗靶标。
[0003]现有针对Legumain开发的抑制剂主要包括寡核苷酸类，天然药物分子类，小分子化合物类等，但寡核苷酸类抑制剂体内稳定性差，易降解，生物利用度低；天然药物分子类成分复杂，具有多靶点效应，机制尚不明确；部分小分子化合物类存在特异性不足，生物利用度低等问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对现有技术存在的上述不足，提出一类Legumain蛋白抑制剂及其应用，能够特异性抑制肿瘤细胞中高表达的Legumain蛋白，通过与Legumain蛋白的结合域结合，抑制其活性并降低蛋白表达，从而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，并诱导降低肿瘤细胞对化疗的耐受能力，具有特异性好，生物利用度高，无肝肾毒副作用等特点，可用于治疗乳腺癌，其作用机制明确，能有效抑制肿瘤的转移和侵袭。
[0005]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0006]本专利技术涉及一类Legumain蛋白抑制剂的合成方法，以CH2CH(NH2)COOH为原料，加入为CH3CHO、NaBH3CN并以H2O和CH3OH为溶剂混合后室温反应得到CH2CH[N(CH2CH3)2]COOH；通过加入肼基甲酸叔丁酯(NH2NHBoc)、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺(EDC)、1
‑
羟基苯并三氮唑(HOBt)、N,N
‑
二异丙基乙胺(DIEA)并以CH2Cl2为溶剂室温反应得到CH2CH[N(CH2CH3)2]CONHNHBoc；进一步加入三氟乙酸(TFA)、二氯甲烷(DCM)并以CH2Cl2为溶剂室温反应得到CH2CH[N(CH2CH3)2]CONHNF2TFA，再加入NH2COCH2Br、 K2CO3并以四氢呋喃(THF)为溶剂室温反应得到CH2CH[N(CH2CH3)2]CONHCH2CONH2，最后加入ClCOCH2R，Na2CO3并以THF为溶剂室温反应得到 CH2CH[N(CH2CH3)2]CON(COCH2R)CH2CONH2。
[0007]所述的方法的合成路线具体为：
[0008][0009]其中：基团R为H、C1‑6烷基、C2‑6不饱和脂肪链烷基、C2‑6不饱和脂肪链羟基、C3‑6环烷基、卤代C1‑6烷基、羟基C1‑6烷基、氨基C1‑6烷基、卤代C2‑6不饱和脂肪链烷基、C1‑6烷基
‑ꢀ
C3‑6环烷基或卤代C3‑6环烷基。
[0010]本专利技术涉及一类Legumain蛋白抑制剂，其化学结构式为：
[0011]所述的Legumain蛋白抑制剂优选为以下任一一种结构及其药学上可接受的盐或氘代物：
[0012]①②③④⑤⑥
⑦
以及
⑧
[0013]本专利技术涉及一种基于上述Legumain蛋白抑制剂的应用，将其用于制备抗肿瘤药物或抗阿尔兹海默症药物。
[0014]所述的肿瘤，具体为人乳腺癌细胞MDA
‑
MB
‑
231或小鼠高转移性乳腺癌细胞4T1.2。
[0015]所述的药物，其有效剂量优选为1mg
‑
800mg/天。技术效果
[0016]与现有技术相比，本专利技术合成路线步骤较少，反应条件简单，工业合成门槛较低，具有较好的工业实用性，制备得到的抑制剂在不具备细胞毒性的基础上，抑制肿瘤细胞转移侵袭，并结合对破骨细胞的抑制效果对乳腺癌细胞骨转移具有抑制作用。
附图说明
[0017]图1为实施例中S6(CH2CH[N(CH2CH3)2]CON(COCH2Cl)CH2CONH2)的核磁共振图谱1H
‑
NMR(400MHz，DMSO
‑
d6)；
[0018]图2A
‑
D分别为实施例中化合物
①
药物与AEP酶分子对接后的活化能变化、结合位点示意图；
[0019]图2E、F为实施例中给予不同浓度化合物
①
后AEP酶活性的时间变化规律及差异倍数示意图；
[0020]图2G、H为实施例中给予不同浓度化合物
①
后在细胞与上清液中AEP的酶活性及差异倍数示意图，其中图2G为实施例中化合物
①
处理4T1.2细胞96h后AEP的表达水平示意图；
[0021][0022]图2I、J为实施例中化合物
①
处理4T1.2细胞与4T1.2 AEP KO细胞96h后AEP的表达水平及差异倍数示意图；
[0023]图3A
‑
F分别为实施例中给予化合物
①
后E
‑
cadherin、Snail、MMP
‑
9蛋白的表达情况示意图；
[0024]图4A为实施例中乳腺癌细胞MDA
‑
MB
‑
23与4T1.2细胞在给予化合物
①
的情况下细胞活力实验结果示意图；
[0025]图4B
‑
E分别为实施例中4T1.2细胞与MDA
‑
MB
‑
231细胞划痕实验结果示意图；
[0026]图4F为实施例中不同浓度化合物
①
与AEP KO刺激后的侵袭细胞示意图；
[0027]图4G为对应的统计图；
[0028]图5为实施例中4组小鼠的生存曲线示意图；
[0029]图6A
‑
D分别为实施例中PBS、0.44mg/ml表柔比星、0.44mg/ml表柔比星+0.7mg/ml 化合物
①
、0.44mg/ml表柔比星+10mg/ml化合物
①...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一类Legumain蛋白抑制剂的合成方法，其特征在于，以CH2CH(NH2)COOH为原料，加入为CH3CHO、NaBH3CN并以H2O和CH3OH为溶剂混合后室温反应得到CH2CH[N(CH2CH3)2]COOH；通过加入NH2NHBoc、EDC、HOBt、DIEA并以CH2Cl2为溶剂室温反应得到CH2CH[N(CH2CH3)2]CONHNHBoc；进一步加入TFA、DCM并以CH2Cl2为溶剂室温反应得到CH2CH[N(CH2CH3)2]CONHNF2TFA，再加入NH2COCH2Br、K2CO3并以THF为溶剂室温反应得到CH2CH[N(CH2CH3)2]CONHCH2CONH2，最后加入ClCOCH2R，Na2CO3并以THF为溶剂室温反应得到CH2CH[N(CH2CH3)2]CON(COCH2R)CH2CONH2；所述的方法的合成路线具体为：其中：基团R为H、C1‑6烷基、C2‑6不饱和脂肪链烷基、C2‑6不饱和脂肪链羟基、C3‑6环烷基、卤代C1‑6烷基、羟基C1‑6烷基、氨基C1‑6烷基、卤代C2‑6不饱和脂肪链烷基、C1‑6烷基
‑
C3‑6环烷基或卤代C3‑6环烷基。2.根据权利要求1所述的Legumain蛋白抑制剂的合成方法，其特征是，具体包括：步骤1)将原料CH2CH(NH2)COOH溶于冰水和甲醇的混合溶剂中，然后将NaBH3CN分批加入，搅拌几分钟后逐滴滴加乙醛后在室温下反应，然后将浓盐酸缓慢加入调节pH至1.5，并进一步反应后进行TLC检测反应，反应结束后先旋掉甲醇，然后加二氯甲烷萃取杂质，将水相旋干后加入甲醇溶解硅胶拌样，再用柱层析纯化后得到黄色油状物CH2CH[N(CH2CH3)2]COOH；步骤2)将CH2CH[N(CH2CH3)2]COOH溶解于二氯甲烷中，分别加入NH2NHBoc，EDC，HOBT，最后加入DIEA，反应后TLC检测并加水洗涤及二氯甲烷萃取，得到CH2CH[N(CH2CH3)2]CONHN...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭方，陈峻崧，徐文克，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：