一种口蹄疫病毒O型、A型的抗体联检试剂盒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了口蹄疫病毒O型、A型的抗体联检试剂盒，该抗体联检试剂盒包括口蹄疫病毒O型、A型抗体检测芯片、酶标试剂，该口蹄疫病毒O型、A型抗体检测芯片上的点样点，分别包被有口蹄疫病毒O型抗原、口蹄疫病毒A型抗原、质控品、空白对照；该O型口蹄疫病毒抗原为O型口蹄疫病毒样颗粒，该A型口蹄疫病毒抗原为A型口蹄疫病毒样颗粒，该质控品为羊抗鼠多克隆抗体，该空白对照为点样液，该酶标试剂为含有酶标记O型口蹄疫病毒单克隆抗体7D2、酶标记A型口蹄疫病毒单克隆抗体3B4的溶液。本发明专利技术的抗体联检试剂盒不仅具有高灵敏度，且克服了现有技术中不同批次之间检测结果差异大的缺陷，能有效用于疫苗质量控制等多种非免疫诊断应用。疫苗质量控制等多种非免疫诊断应用。疫苗质量控制等多种非免疫诊断应用。

【技术实现步骤摘要】
一种口蹄疫病毒O型、A型的抗体联检试剂盒及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种口蹄疫病毒O型、A型的抗体联检试剂盒及其制备方法与应用，属于生物医药领域。

技术介绍

[0002]口蹄疫是由口蹄疫病毒感染引起的偶蹄动物易患的一种热性、急性、高度接触性传染病。该病传播迅速，发病率高，该病的爆发和流行给全球养殖业带来了巨大的经济损失，被世界动物卫生组织(OIE)和联合国粮农组织(FAO)将其列为A类烈性传染病之首，我国将其列为一类传染病第一位。口蹄疫病毒分为7个血清型和80多个亚型，极易发生变异，其中7个血清型包括A型、O型、Asia I型、C型、SAT1型、SAT2型、和SAT3型，以O型、A型口蹄疫病毒流行最为广泛。按遗传分类，O型口蹄疫病毒主要流行三种遗传拓扑型(Topotype)，分别属于CATHAY型(中国型)、ME
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SA型(中东
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南亚型)和SEA型(东南亚型)。由于不同型的疫苗之间无交叉免疫保护作用，作为同一血清型O型内不同亚型的抗原性也有不同程度的差别，其产生的抗体的血清学交叉反应的程度也各不相同，这就要求抗体检测方法必须特异和稳定。
[0003]目前，对口蹄疫的防控主要是疫苗免疫为主，对疫苗免疫后抗体水平的监测是控制疫苗免疫效果的必要措施。市场上常用的口蹄疫血清学检测方法主要有：病毒中和试验(VNT)、液相阻断ELISA方法(LPB
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ELISA)，其中，病毒中和试验是抗体测定的金标准，但该方法需要动用活病毒，且只能在特定的高级别实验室中才能操作，操作相对复杂、耗时约5天且存在生物安全风险；液相阻断ELISA试剂盒为商品化试剂盒，应用相对较多，但操作步骤繁琐、耗时约4小时，批次间检测结果不稳定，且该试剂盒的捕获抗体和酶标抗体使用的都是多抗，多抗血清经常出现品质不均匀，影响检测结果。此外上述方法均为单指标检测，一次只能检测一种抗体，样品检测量大且耗时耗力。因此，开发一种能将抗原直接固相制备抗原板，且一次可以同时检测FMDV O型、A型抗体的试剂盒，并解决重复性不佳的问题，提高敏感性与特异性，对该病的诊断和预防具有重要意义。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种口蹄疫病毒O型、A型的抗体联检试剂盒，其中，所述抗体联检试剂盒包括一个或多个口蹄疫病毒O型、A型抗体检测芯片、酶标试剂，所述口蹄疫病毒O型、A型抗体检测芯片上的点样点，分别包被有口蹄疫病毒O型抗原、口蹄疫病毒A型抗原、质控品、空白对照；所述O型口蹄疫病毒抗原为O型口蹄疫病毒样颗粒，所述A型口蹄疫病毒抗原为A型口蹄疫病毒样颗粒，所述质控品为羊抗鼠多克隆抗体，所述空白对照为点样液，所述酶标试剂为含有酶标记O型口蹄疫病毒单克隆抗体和酶标记A型口蹄疫病毒单克隆抗体的溶液，所述酶标记O型口蹄疫病毒单克隆抗体为酶标记O型口蹄疫病毒单克隆抗体7D2或酶标记O型口蹄疫病毒单克隆抗体6G6、所述酶标记A型口蹄疫病毒单克
隆抗体为酶标记A型口蹄疫病毒单克隆抗体3B4或酶标记A型口蹄疫病毒单克隆抗体2E11。
[0005]作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术所述的抗体联检试剂盒中，所述O型口蹄疫病毒抗原的包被量为1～128ng/点；所述A型口蹄疫病毒抗原的包被量为1～128ng/点；O型口蹄疫病毒单克隆抗体7D2的重链可变区如SEQ.ID NO.7或其简并序列编码，轻链可变区如SEQ.ID NO.8或其简并序列编码；O型口蹄疫病毒单克隆抗体6G6的重链可变区如SEQ.ID NO.5或其简并序列编码，轻链可变区如SEQ.ID NO.6或其简并序列编码；A型口蹄疫病毒单克隆抗体3B4的重链可变区如SEQ.ID NO.3或其简并序列编码，轻链可变区如SEQ.ID NO.4或其简并序列编码；A型口蹄疫病毒单克隆抗体2E11的重链可变区如SEQ.ID NO.1或其简并序列编码，轻链可变区如SEQ.ID NO.2或其简并序列编码；所述酶标试剂所用的缓冲液为含有体积比20％胎牛血清的PBS溶液，其中所述酶标记O型口蹄疫病毒单克隆抗体7D2、酶标记A型口蹄疫病毒单克隆抗体3B4的终浓度分别为100ng/ml、75ng/ml；所述酶标试剂所标记的酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β
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D
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半乳糖苷酶；所述质控品点样于质控品点1～3，所述质控品点1的包被量为大于等于1ng/点而小于4ng/点；所述质控品点2的包被量为4ng/点；所述质控品点3的包被量为大于4ng/点而小于等于6ng/点；所述点样液为5％甘油溶液、5％山梨醇溶液、0.05％曲拉通溶液、DMSO溶液、PBS(pH6.8)溶液按照10∶15∶0.1∶50∶100的体积比混合均匀而成。
[0006]通过对上述抗原包被量进一步优化选择，保证了检测的高灵敏度。
[0007]本专利技术经实验研究，限定特定的A型口蹄疫病毒抗原包被量、特定的O型口蹄疫病毒抗原包被量、特定的羊抗鼠多克隆抗体的包被量、特定的酶标记A型口蹄疫病毒单克隆抗体含量、特定的酶标记O型口蹄疫病毒单克隆抗体含量，实现了对样品中血清抗体的高灵敏度检测。
[0008]与传统ELISA试剂盒均设有阴性对照、阳性对照或标准品作为试剂盒内质控品相比，本专利技术所述联检试剂盒通过技术提升，在反应载体上设有质控品，且该质控品为商品化羊抗鼠多克隆抗体，不需要再在试剂盒中设有阴性对照、阳性对照，也就是说不仅不需要提前筛选动物进行免疫或攻毒、采集血清等繁琐的制备步骤和人力、动物试验场地成本，还大大提升试剂盒操作便捷性及准确性。特别地，避免了一类传染病病毒即口蹄疫病毒必须在高级别实验室操作的麻烦。本专利技术经研究发现特定含量的羊抗鼠多克隆抗体可作为质控品，无需设阴性对照、阳性对照，羊抗鼠多克隆抗体的作用在于作为单个检测孔内无抗体反应时的反应对照，用于评估试验的有效性，体现无阻断时酶标试剂的反应程度。而羊抗鼠多克隆抗体可以商业上购买或通过常规方法制备，操作简便。本专利技术经研究发现特定含量及成分的样品稀释液，提高了试剂盒的检测灵敏度及特异性。
[0009]作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术所述的抗体联检试剂盒中，所述O型口蹄疫病毒抗原包被量为8～32ng/点；所述A型口蹄疫病毒抗原的包被量为16～64ng/点；所述质控品点1～3的羊抗鼠多克隆抗体包被量分别为2ng/点、4ng/点和6ng/点。
[0010]作为本专利技术的一种更优选实施方式，本专利技术所述的抗体联检试剂盒中，所述O型口蹄疫病毒抗原包被量为16ng/点。
[0011]作为本专利技术的一种更优选实施方式，本专利技术所述的抗体联检试剂盒中，所述A型口蹄疫病毒抗原包被量为32ng/点。
[0012]作为本专利技术的一种最优选实施方式，本专利技术所述的抗体联检试剂盒中，所述口蹄
疫病毒O型、A型的抗体联检试剂盒中所述口蹄疫病毒O型抗原的包被量为16ng/点，所述口蹄疫病毒A型抗原的包被量为32ng/点。
[0013]作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术所述的抗体联检试剂盒中，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种口蹄疫病毒O型、A型的抗体联检试剂盒，其中，所述抗体联检试剂盒包括一个或多个口蹄疫病毒O型、A型抗体检测芯片、酶标试剂，所述口蹄疫病毒O型、A型抗体检测芯片上的点样点，分别包被有口蹄疫病毒O型抗原、口蹄疫病毒A型抗原、质控品、空白对照；所述O型口蹄疫病毒抗原为O型口蹄疫病毒样颗粒，所述A型口蹄疫病毒抗原为A型口蹄疫病毒样颗粒，所述质控品为羊抗鼠多克隆抗体，所述空白对照为点样液，所述酶标试剂为含有酶标记O型口蹄疫病毒单克隆抗体和酶标记A型口蹄疫病毒单克隆抗体的溶液，所述酶标记O型口蹄疫病毒单克隆抗体为酶标记O型口蹄疫病毒单克隆抗体7D2或酶标记O型口蹄疫病毒单克隆抗体6G6、所述酶标记A型口蹄疫病毒单克隆抗体为酶标记A型口蹄疫病毒单克隆抗体3B4或酶标记A型口蹄疫病毒单克隆抗体2E11。2.根据权利要求1所述的抗体联检试剂盒，其中，所述O型口蹄疫病毒抗原的包被量为1～128ng/点；优选地，所述O型口蹄疫病毒抗原包被量为8～32ng/点；更优选地，所述O型口蹄疫病毒抗原包被量为16ng/点；所述A型口蹄疫病毒抗原的包被量为1～128ng/点；所述A型口蹄疫病毒抗原的包被量为16～64ng/点；所述A型口蹄疫病毒抗原包被量为32ng/点；所述O型口蹄疫病毒单克隆抗体7D2的重链可变区如SEQ.ID NO.7或其简并序列编码，轻链可变区如SEQ.ID NO.8或其简并序列编码；所述O型口蹄疫病毒单克隆抗体6G6的重链可变区如SEQ.ID NO.5或其简并序列编码，轻链可变区如SEQ.ID NO.6或其简并序列编码；所述A型口蹄疫病毒单克隆抗体3B4的重链可变区如SEQ.ID NO.3或其简并序列编码，轻链可变区如SEQ.ID NO.4或其简并序列编码；所述A型口蹄疫病毒单克隆抗体2E11的重链可变区如SEQ.ID NO.1或其简并序列编码，轻链可变区如SEQ.ID NO.2或其简并序列编码；优选地，所述酶标试剂为含有酶标记O型口蹄疫病毒单克隆抗体7D2、酶标记A型口蹄疫病毒单克隆抗体3B4的溶液；所述酶标试剂所用缓冲液为含有体积比20％胎牛血清的PBS溶液，其中所述酶标记O型口蹄疫病毒单克隆抗体7D2、酶标记A型口蹄疫病毒单克隆抗体3B4的终浓度分别为100ng/ml、75ng/ml；所述酶标试剂所标记的酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β
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半乳糖苷酶；所述质控品点样于质控品点1～3，所述质控品点1的包被量为大于等于1ng/点而小于4ng/点；所述质控品点2的包被量为4ng/点；所述质控品点3的包被量为大于4ng/点而小于等于6ng/点；优选地，所述质控品点1～3的羊抗鼠多克隆抗体包被量分别为2ng/点、4ng/点和6ng/点；所述点样液为5％甘油溶液、5％山梨醇溶液、0.05％曲拉通溶液、DMSO溶液、PBS(pH6.8)溶液按照10∶15∶0.1∶50∶100的体积比混合均匀而成；进一步优选地，所述口蹄疫病毒O型、A型的抗体联检试剂盒中所述口蹄疫病毒O型抗原的包被量为16ng/点，所述口蹄疫病毒A型抗原的包被量为32ng/点。3.根据权利要求1所述的抗体联检试剂盒，其中，所述试剂盒还包含样品稀释液、底物液、洗涤液；所述样品稀释液为含10％V/V胎牛血清、0.05％～0.2％V/V Triton
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100、0.1％V/V Proclin300的PBS溶液；优选地，所述样品稀释液含0.1％V/V Triton
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100；
所述底物液为TMB(3,3',5,5'
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四甲联苯胺)溶液；所述洗涤液为含1％V/V吐温20的PBS溶液。4.根据权利要求1～3所述的抗体联检试剂盒，其中，所述检测芯片中质控品点(1)、质控品点(2)、质控品点(3)的所述羊抗鼠多克隆抗体包被量分别是2ng/点、4ng/点、以及6ng/点、空白对照点样点(4)为背景检测点样点，所述口蹄疫病毒A型抗原点样于点样点(5)，所述口蹄疫病毒O型抗原点样于点样点(6)...

【专利技术属性】
技术研发人员：田克恭，李玉芳，张许科，
申请(专利权)人：洛阳中科生物芯片技术有限公司，
类型：发明
国别省市：