一种猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白的抗体联检试剂盒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种含猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体的抗体联检试剂盒，该联检试剂盒包括一个或多个猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体检测芯片、酶标试剂，该检测芯片包被有猪伪狂犬病病毒gD蛋白、gE蛋白、质控品、空白对照点，该酶标试剂为含有酶标记猪伪狂犬病病毒gD、及gE蛋白单克隆抗体的溶液，该质控品为羊抗鼠多克隆抗体，其包被量为1～4ng/点。本发明专利技术制备的试剂盒在反应载体上设有质控品，不需要在再试剂盒中设有阴性对照、阴性对照，快速检测，操作简便，且高度集成，一键式智能化数据处理，可用于检测猪群中猪伪狂犬病病毒感染状态、评估猪群中猪伪狂犬病病毒疫苗免疫效果及鉴别新引种猪猪伪狂犬病病毒感染情况，便于制定免疫程序及早期净化。早期净化。早期净化。

【技术实现步骤摘要】
一种猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白的抗体联检试剂盒及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白的抗体二联检测试剂盒、三联检测试剂盒及其制备方法与应用，属于生物医药领域。

技术介绍

[0002]伪狂犬病(Pseudorabies，PR；又名奥耶斯基氏病，Aujeszky
’
s disease)，是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒I型(Suid herpes virus I)所引起的猪、牛、羊等多种家畜及野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)、脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。猪是该病的主要贮存宿主和传染源。猪伪狂犬病病毒可以感染不同年龄段的猪，但以妊娠母猪和哺乳仔猪感染最为严重：导致妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎；育肥猪感染猪伪狂犬病病毒时表现为呼吸道症状，无并发症时死亡率低；哺乳仔猪出现神经症状、麻痹、衰竭死亡，死亡率几乎高达100％，断奶仔猪发病率约40％，死亡率可达20％，对我国乃至全球养猪业的健康发展造成了巨大的经济损失，成为严重危害养猪业健康发展的重大传染病之一。
[0003]在伪狂犬病的防治工作中，监测和检测猪血清中伪狂犬病病毒抗体的水平是非常重要的一个环节。现有技术中对于猪伪狂犬病病毒疫苗的免疫效果的检测需要耗时较长的中和试验测定过程，临床上急需简便的、快速的检测猪伪狂犬病病毒活疫苗免疫效果和活疫苗质量检测。
[0004]预防猪伪狂犬病主要通过猪伪狂犬病病毒gE基因缺失弱毒疫苗进行，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)在被免疫的猪血清中不能检测到针对gE蛋白的抗体，这一差异为利用血清进行伪狂犬野生毒株感染和gE基因缺失疫苗免疫接种进行鉴别诊断提供条件。传统ELISA试剂盒内设定有阴性对照品、阳性对照品或标准品作为试剂盒内质控品，内控品需要经过筛选动物、专门的动物房及专业的人员饲养、免疫、取样、灭活、标定及分装等复杂的工序。特别地，临床上病情复杂，疫苗免疫猪、野毒株感染猪、无免疫无感染阴性猪常呈杂居状态，临床上迫切需要提供一种对猪群免疫情况及抗体保护性概况、野毒感染与否及其进程情况进行科学评价的方法，以便更好的指导养殖。
[0005]中国专利CN103792373A、CN106405082A利用胶体金检测技术制备同时检测PRVgD、gE抗体的胶体金检测试纸条，但检测结果无法准确定量，通过检测结果中PRVgD抗体高低及PRVgE抗体高低即可综合判断猪只或猪群是健康状态还是感染早期、中期或晚期，从而指导临床制定免疫策略及净化措施。
[0006]猪瘟(Classical swine fever)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度接触性传染病，以很强的传染性和高致死率为特征，不同年龄、性别和品种的猪均能感染，是世界粮农组织和各国政府密切关注的主要传染病之一。临床上该病与猪伪狂犬病极易混合感染。日常预防两种疾病需要进行二次免疫，考虑到实际生产，多次免疫会对动物机体产生刺激而影响其生长，又会提高饲养中的劳动强度、增加劳动成本，
为此研制开发二联苗，但贺卫洁(猪瘟和猪伪狂犬病二联苗免疫干扰现象的研究,河北农业大学硕士学位论文,2016)研究发现猪瘟、猪伪狂犬病二联苗同时免疫仔猪后猪伪狂犬病会干扰猪瘟前期抗体的产生。这些实验结果均需要相应的试剂盒进行监测，以避免免疫效果不实造成猪只发病或死亡，而目前市售的均为单独试剂盒，而且监控时操作、计算均费时费事，耗时较长。

技术实现思路

[0007]为了解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白的抗体联检试剂盒，其中，所述抗体联检试剂盒包括一个或多个猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体检测芯片、酶标试剂，所述猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体检测芯片包被有猪伪狂犬病病毒gD蛋白、猪伪狂犬病病毒gE蛋白、质控品、空白对照点，所述质控品为羊抗鼠多克隆抗体，所述空白对照点为检测背景值，所述酶标试剂为含有酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体、酶标记猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体的溶液；所述羊抗鼠多克隆抗体的包被量为1～4ng/点；所述质控品点共三个点，质控品点1的包被量为大于等于1ng/点而小于2ng/点；质控品点2的包被量为2ng/点；质控品点3的包被量为大于2ng/点而小于等于4ng/点。
[0008]与传统ELISA试剂盒均设有阴性对照、阳性对照或标准品作为试剂盒内质控品相比，本专利技术所述联检试剂盒通过技术提升，在反应载体上设有质控品，且该质控品为商品化羊抗鼠多克隆抗体，不需要再在试剂盒中设有阴性对照、阴性对照，也就是说不仅不需要提前筛选动物进行免疫或攻毒、采集血清等繁琐的制备步骤和人力、动物试验场地成本，还大大提升试剂盒操作便捷性及准确性。本专利技术经研究发现在一定含量范围内的羊抗鼠多克隆抗体可作为质控品，无需设阴性对照、阴性对照，羊抗鼠多克隆抗体的作用在于作为单个检测孔内无抗体反应时的反应对照，用于评估试验的有效性，体现无阻断时酶标试剂的反应程度。而羊抗鼠多克隆抗体可以商业上购买或通过常规方法制备，操作简便。
[0009]所述羊抗鼠多克隆抗体包被量可以为1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0ng/点。
[0010]作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术所述联检试剂盒中，所述猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体检测芯片包被的猪伪狂犬病病毒gD蛋白为猪伪狂犬病病毒HN1201株的gD蛋白，所述包被的猪伪狂犬病病毒gE蛋白为猪伪狂犬病病毒HN1201株的gE蛋白；所述酶标试剂中所述酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体为酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体5G7或/和3B6，所述酶标记猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体为酶标记猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体11H1，当所述酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体为酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体5G7和3B6时，所述酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体5G7和所述酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体3B6含量比例为1∶1；所述猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体检测芯片中所述猪伪狂犬病病毒gD蛋白的包被量为0.05～10ng/点，所述猪伪狂犬病病毒gE蛋白的包被量为0.02～8ng/点，所述羊抗鼠多克隆抗体的包被量为1ng/点、2ng/点、和4ng/点；所述酶标试剂中所述酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体5G7、3B6的IFA效价均为1∶3200～1∶6400，所述酶标记猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体11H1的IFA效价为1∶3200～1∶6400，所述酶标试剂为含终体积20％V/V胎牛血清的PBS溶液，
其中还含有终体积0.05％V/V的所述酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体5G7和/或3B6，以及终体积0.05％V/V的所述酶标记本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白的抗体联检试剂盒，其中，所述抗体联检试剂盒包括一个或多个猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体检测芯片、酶标试剂，所述猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体检测芯片包被有猪伪狂犬病病毒gD蛋白、猪伪狂犬病病毒gE蛋白、质控品、空白对照点，所述质控品为羊抗鼠多克隆抗体，所述空白对照点为检测背景值，所述酶标试剂为含有酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体、酶标记猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体的溶液；所述羊抗鼠多克隆抗体的包被量为1～4ng/点；所述质控品点共三个点，质控品点1的包被量为大于等于1ng/点而小于2ng/点；质控品点2的包被量为2ng/点；质控品点3的包被量为大于2ng/点而小于等于4ng/点。2.根据权利要求1所述的抗体联检试剂盒，其中，所述猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体检测芯片包被的猪伪狂犬病病毒gD蛋白为猪伪狂犬病病毒HN1201株的gD蛋白，所述包被的猪伪狂犬病病毒gE蛋白为猪伪狂犬病病毒HN1201株的gE蛋白；所述酶标试剂中所述酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体为酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体5G7或/和3B6，所述酶标记猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体为酶标记猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体11H1，当所述酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体为酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体5G7和3B6时，所述酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体5G7和所述酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体3B6含量比例为1∶1；所述猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体检测芯片中所述猪伪狂犬病病毒gD蛋白的包被量为0.05～10ng/点，优选地，所述猪伪狂犬病病毒gD蛋白的包被量为0.25～8ng/点，更优选地，所述猪伪狂犬病病毒gD蛋白的包被量为4ng/点；所述猪伪狂犬病病毒gE蛋白的包被量为0.02～8ng/点，优选地，所述猪伪狂犬病病毒gE蛋白的包被量为0.1～4ng/点，更优选地，所述猪伪狂犬病病毒gE蛋白的包被量为1ng/点；所述羊抗鼠多克隆抗体的包被量为1ng/点、2ng/点和4ng/点；进一步优选地，所述猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体检测芯片中所述猪伪狂犬病病毒gD蛋白的包被量为4ng/点、或2ng/点，所述猪伪狂犬病病毒gE蛋白的包被量为2ng/点、或1ng/点；所述酶标试剂中所述酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体5G7、3B6的IFA效价均为1∶3200～1∶6400，所述酶标记猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体11H1的IFA效价为1∶3200～1∶6400，所述酶标试剂为含终体积20％V/V胎牛血清的PBS溶液，其中还含有终体积0.05％V/V的所述酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体5G7和/或3B6，以及终体积0.05％V/V的所述酶标记猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体11H1。3.根据权利要求1所述的抗体联检试剂盒，其中，所述抗体联检试剂盒还包括样品稀释液、底物液、洗涤液；所述样品稀释液为含10％V/V胎牛血清、0.1％V/V吐温20、1％W/V BSA、0.05％～0.5％W/V Casein、1％W/V Proclin300的PBS溶液，所述底物液为TMB溶液，所述洗涤液为含1％V/V吐温20的PBS溶液；优选地，所述样品稀释液为含10％V/V胎牛血清、0.1％V/V吐温20、1％W/V BSA、0.1％W/V Casein、1％W/V Proclin300的PBS溶液，所述底物液为1-step Ultra TMB。4.根据权利要求2所述的抗体联检试剂盒，其中，所述猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体
检测芯片还包被有CSFV E2蛋白；所述CSFV E2蛋白的包被量为0.05～12.8ng/点；优选地，所述CSFV E2蛋白的包被量为0.2～6.4ng/点；优选地，所述CSFV E2蛋白的包被量为6.4ng/点；进一步优选地，所述猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体检测芯片包被有4.0ng/点猪伪狂犬病病毒gD蛋白、1.0ng/点猪伪狂犬病病毒gE蛋白和6.4ng/点CSFV E2蛋白；所述酶标试剂中还包含终体积0.05％V/V的酶标CSFV E2单克隆抗体15A9，所述酶标抗体15A9的IFA效价为1∶6400～1∶25600。5.根据权利要求1～4所述的抗体联检试剂盒，其中，所述检测芯片中所述质控品点(1)、所述质控品点(2)、所述质控品点(3)的所述羊抗鼠多克隆抗体包被量分别是1ng/点、2ng/点、以及4ng/点、空白对照点样点(4)为背景检测点样点，所述猪伪狂犬病病毒gD蛋白点样于点样点(5)，所述猪伪狂犬病病毒gE蛋白点样于点样点(6)，所述CSFV E2蛋白点样于点样点(7)；所述质控品点(1)、所述质控品点(2)、所述质控品点(3)、所述空白对照点样点(4)点样点分别固定于检测芯片的左上角、左下角、右下角、右上角，所述点(5)、(6)、(7)可以分别点样于所述检测芯片其他位置，与其他任一点的边缘相距≥700μm，而所述点样点(1)至(7)中点与点边缘之间的最短距离也为≥700μm；所述质控品点(1)、所述质控品点(2)、所述质控品点(3)、所述空白对照点样点(4)到检测芯片亚...

【专利技术属性】
技术研发人员：田克恭，昌静峰，李玉芳，张许科，
申请(专利权)人：洛阳中科生物芯片技术有限公司，
类型：发明
国别省市：