人源化细胞瞬时表达用表达载体、表达系统、构建方法及其应用技术方案

本发明专利技术属于重组蛋白表达技术领域，具体涉及人源化细胞瞬时表达载体、表达系统及其应用。本发明专利技术构建的表达载体，引入TRE/TAP组成的反式激活蛋白元件，并且TAP作为独立表达框，相比未引入该元件的表达载体，能够成倍提高目的蛋白瞬时表达量；更进一步的，本发明专利技术将TRE/TAP组成的反式激活蛋白元件与核基质结合区元件MAR和IRES复配使用，相互之间协同增效，进一步提高目的蛋白的瞬时表达量。由此，本发明专利技术提供的表达载体和表达系统能够应用于制备蛋白类药物。药物。药物。

【技术实现步骤摘要】
人源化细胞瞬时表达用表达载体、表达系统、构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于重组蛋白表达
，具体涉及人源化细胞瞬时表达载体、表达系统及其应用。

技术介绍

[0002]随着基因工程技术的发展，利用基因工程生产的重组蛋白质类的数量和种类正在不断的增加，并且已经成为医药工业的重要部分。重组药物蛋白的表达系统主要包括E.coli、酵母以及非人源化哺乳动物细胞系。E.coli适合表达分子量较小、结构相对简单的蛋白质，酵母表达系统适合表达分子量较大、结构较复杂、较少糖基化的蛋白质。结构复杂或糖基化对于蛋白质的活性非常重要，非人源化哺乳动物细胞系如中国仓鼠卵巢细胞虽然具有类似人源化的翻译后加工修饰(post
‑
translational modifications，PTMs)，但其PTMs与人源化细胞还存在差异。因此，人源化细胞目前成为生产人源性治疗性蛋白的首选表达系统，特别是需要较复杂翻译后修饰的蛋白质生产的首选系统。
[0003]重组蛋白的表达有瞬时表达和稳定表达两种，瞬时表达状态下导入细胞的外源基因和宿主细胞染色体DNA不发生整合，能够短时间获得目的蛋白，且其通用性强等优点。但由于细胞中的外源基因会随着细胞分裂而丢失，因此目的蛋白表达只能维持几天到十几天时间，因此存在表达量低的缺点，使其方法的应用受到较大的限制，如何提高人源化细胞重组瞬时表达的目的基因的表达量成为亟待解决的问题。
[0004]目前针对提高人源化细胞重组瞬时表达的方法包括细胞培养过程中添加功能性助剂，比如添加一些生长因子、程序性死亡抑制剂或者共转一些生长因子基因、miRNA分子等，但是该方法存在工艺复杂，所用试剂昂贵，不适合大规模生产的缺陷。同时也包括通过改进和优化表达系统的方式提高目的蛋白表达，比如在表达系统中设置附加体维持系统、强启动子/增强子、蛋白质反式激活系统，但是这些所有元素应当如何组合使用整合至表达载体中形成稳定的表达系统仍然是目前尚需解决的技术问题。
[0005]反式激活蛋白(transactivator protein，TAP)是一种来自HIV病毒RNA结合蛋白，具有转录激活的作用，能够通过结合在HIV RNA的5'端形成的反式激活反应元件(transactivation response element，TRE)茎环结构，激活HIV
‑
1中的转录。TAP与TRE的结合能够促进转录延长，进而提高下游基因表达。如何使用TAP/TRE，以及与其他元件配合，构建人源化细胞重组表达系统，进一步提高目的蛋白表达量是本专利技术需要解决的技术问题。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的之一在于提供人源化细胞瞬时表达用表达载体，通过在表达系统中引入反式激活蛋白元件，提高目的蛋白表达量。
[0007]本专利技术的目的之二在于提供人源化细胞瞬时表达系统。
[0008]本专利技术的目的之三在于提供人源化细瞬时表达系统构建方法。
[0009]本专利技术的目的之四在于提供本专利技术人源化细胞瞬时表达系统应用于重组表达目的蛋白。
[0010]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0011]人源化细胞瞬时表达用表达载体，该载体包含在启动子和目的基因之间插入的TRE编码序列；和插入目的基因下游的TAP表达框。
[0012]进一步优选的，所述启动子上游和TAP表达框下游还插入有核基质结合区序列。
[0013]进一步优选的，所述TAP表达框的结构为IRES
‑
TAP
‑
PolyA；该载体的结构为核基质结合区序列
‑
启动子
‑
TRE
‑
目的基因
‑
IRES
‑
TAP
‑
PolyA
‑
核基质结合区序列。
[0014]可选的，所述TRE编码序列如SEQ ID NO:1所示；所述TAP编码序列如SEQ ID NO:2所示。
[0015]可选的，所述核基质结合区序列为β
‑
珠蛋白MAR序列；IRES序列为HRV IRES序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述启动子为CMV。
[0016]可选的，所述人源化细胞选自HEK293；更优选的，选自HEK293T细胞、HEK293H细胞、HEK293E细胞、HEK293F细胞或者HEK293S细胞。
[0017]人源化细胞瞬时表达系统，包含上述表达载体。
[0018]上述人源化细胞瞬时表达系统的构建方法，包括以下操作步骤：
[0019]1)构建表达载体：在pIRES
‑
Neo载体中构建形成核基质结合区序列
‑
启动子
‑
TRE
‑
目的基因
‑
IRES
‑
TAP
‑
PolyA
‑
核基质结合区序列表达盒，构建形成表达载体；
[0020]2)插入目的基因：将目的基因插入表达载体的启动子与IRES序列之间，构建形成重组表达载体；
[0021]3)构建表达系统：将重组表达载体转染进入宿主细胞，构建获得瞬时表达系统。
[0022]本专利技术构建的表达载体以及插入目的基因转染进入人源化来源的宿主细胞构建的表达系统，引入TRE/TAP组成的反式激活蛋白元件，并且TAP作为独立表达框，相比未引入该元件的表达载体，能够成倍提高目的蛋白瞬时表达量；更进一步的，本专利技术将TRE/TAP组成的反式激活蛋白元件与核基质结合区元件和IRES复配使用，相互之间协同增效，进一步提高目的蛋白的瞬时表达量。由此，本专利技术提供的表达载体和表达系统能够应用于制备蛋白类药物。
附图说明
[0023]图1为试验例1构建的pIRES
‑
EPO
‑
2序列结构示意图；
[0024]图2为试验例1构建的不同表达系统EPO表达量对比图；
[0025]图3为试验例2构建的不同表达系统HBsAg表达量对比图。
具体实施方式
[0026]下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此；实施例及试验例中所用的培养基、试剂、、细胞系试剂等均为市售商品。
[0027]下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的详细说明。实施例及试验例中所用大肠杆菌(Escherichia coli)JM109、pIRES
‑
Neo质粒载体、细胞系试剂、工具酶等均为市售商品。内切酶及NE Buffer均购自美国New England Biolabs(NEB)公司，pIRES
‑
Neo质粒载体
购自Clontech生物公司。
[0028]实施例1
[0029]本实施例提供包含TRE/TAP组成的反式激活蛋白元件的表达载体，构建方法的具体步骤包括：<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.人源化细胞瞬时表达用表达载体，其特征在于，该载体包含在启动子和目的基因之间插入的TRE编码序列；和插入目的基因下游的TAP表达框。2.如权利要求1所述的人源化细胞瞬时表达用表达载体，其特征在于，所述启动子上游和TAP表达框下游还插入有核基质结合区序列。3.如权利要求2所述的人源化细胞瞬时表达用表达载体，其特征在于，所述TAP表达框的结构为IRES
‑
TAP
‑
PolyA；该载体的结构为核基质结合区序列
‑
启动子
‑
TRE
‑
目的基因
‑
IRES
‑
TAP
‑ꢀ
PolyA
‑
核基质结合区序列。4.如权利要求3所述的人源化细胞瞬时表达用表达载体，其特征在于，所述TRE编码序列如SEQ ID NO:1所示；所述TAP编码序列如SEQ ID NO:2所示。5.如权利要求4所述的人源化细胞瞬时表达用表达载体，其特征在于，所述核基质结合区序列为β
‑
珠蛋白MAR序列；IRES序列为HRV...

【专利技术属性】
技术研发人员：王天云，林艳，米春柳，李波，耿少雷，陈芷涵，孙秋丽，郭潇，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：