一种用于检测蛋白质互作的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及生物技术技术领域，尤其涉及一种用于检测蛋白质互作的检测方法及试剂盒。该方法基于荧光素酶互补原理用来验证蛋白质相互作用，将Gateway载体技术融合在内构建融合表达载体，利用体外蛋白表达系统翻译迅速得到蛋白溶液，最后用酶联检测分析仪快速检测互作信号。相比烟草瞬转系统，能够更加简单、快速、高效地检测蛋白质之间的互作关系。高效地检测蛋白质之间的互作关系。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测蛋白质互作的检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种用于检测蛋白质互作的检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]目前应用于蛋白质互作的检测技术有酵母双杂交技术(Yeast Two Hybrid,Y2H)、GST融合标签的Pull
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down技术、Co
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IP(免疫共沉淀技术)、荧光共振能量转移技术(FRET)等等。
[0003]酵母双杂交系统(Y2H)利用酵母当中一个Gal转录因子的激活作用通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。GST融合标签的Pull
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down沉降技术，利用基因重组将带有GST标签的载体插入到目标蛋白A上，谷胱甘肽包裹的磁珠与目标融合蛋白结合，加入细胞裂解液后，具有相互作用的蛋白被融合蛋白吸附的原理，检测蛋白之间的互相作用。免疫共沉淀是基于抗原抗体的反应原理，基于两个蛋白之间会发生相互作用，如果用蛋白A的抗体免疫沉淀A也可能将蛋白B沉淀下来，B的这种免疫沉淀被称为免疫共沉淀。荧光能量共振转移(FRET)是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象，当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象。可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm范围以内时，就会产生FRET现象。而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内，一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。
[0004]在技术不断发展下，前人根据双分子荧光互补技术的原理，提出了一种新的方法，可以检测两种蛋白的互作情况，称为LCI技术(Huamin Chen,et al.,Firefly Luciferase Complementation Imaging Assay for Protein
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Protein interaction in Plants.Plant Physiology.2008),当验证两种目标蛋白是否互作时，将荧光素酶分成没有催化作用的两段，一端为N端2～416，为Nluc，另一端为C端398～550，为Cluc，将编码N端片段和C端片段分别克隆重组到不同的表达载体上，然后在N端载体上加上一种目的待测蛋白的基因构成N端验证载体，在C端载体上加上另外一个目标蛋白的基因得到C端验证载体。将N端验证载体和C端验证载体的表达产物混在一起，目标蛋白上融合的报告蛋白不会自发地组装，但是仅当两部分融合蛋白的目的蛋白之间有互作关系时，由于报告基因的两端在空间上距离足够近，因此才能正确组装而发挥荧光素酶的活性，加入其发光底物以后，可以通过相关的仪器来检测其化学发光的有无，若发光，则证明待验证目的蛋白之间存在互作；反之亦然。LCI技术可以利用原生质体表达系统，也可以利用农杆菌介导的瞬时转化表达系统来完成蛋白互作的检验或验证。由于LCI检测的时群体细胞之间的作用，而非单一细胞，所以有效避免了由于单个细胞所造成的假象，排除了细胞自发荧光的干扰。
[0005]前期LCI表达载体其多克隆酶切位点单一，当进行蛋白的互作验证时，待测定基因克隆到表达载体有诸多局限性，而且仅仅能应用于2个蛋白之间的互作验证，不便于实现高
通量的蛋白质互作筛选。
[0006]Gateway技术(Invitrogen):能够克隆一个或多个基因进入到不同的蛋白表达系统，并且大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，去除了冗长的亚克隆步骤，同时还能实现高效的克隆效率。另外，基因在目的载体之间快速简便转移时，还可以保证正确的方向和阅读框，因此Gateway技术被许多研究者应用。
[0007]前人将Gateway技术与LCI技术相结合，利用农杆菌侵染的烟草瞬时转化技术，得到了理论上可以大量验证蛋白互作的方法(Zhaoyang Zhou et al.,Luciferase Complementation Assay for Protein
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Protein Interactions in Plants.Current Protocols in Plant Biology.2018)。但是其操作步骤较为繁琐；培育烟草幼苗周期过长(4周)，瞬时转化也需要3～4天，便利度不够高；若要实现高通量，需要大批量培育烟草幼苗，工作量大。
[0008]Wheat Germ Extract Systerm：Wheat Germ Extract System(麦胚提取物转录/翻译偶联系统)为研究者提供了一个可应用于真核生物的无细胞蛋白表达方法，它是一个转录/翻译偶联的、在一个试管中即可完成实验的系统。提取物系统大大简化了体外翻译过程，缩短了获得翻译结果所需的时间。
[0009]目前尚未见到将Wheat Germ Extract System与LCI技术相结合的报道。

技术实现思路

[0010]有鉴于此，本专利技术提供了一种用于检测蛋白质互作的检测方法及试剂盒。提供了一种简单、快捷、高效的蛋白互作筛选和验证的方法以及相应的LCI表达载体的试剂盒。
[0011]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0012]一种检测蛋白互作的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0013]1)构建表达荧光素酶N端2～417位多肽片段Nluc的N端载体P
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Nluc
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G，以及表达荧光素酶398～550位多肽片段Cluc的C端载体P
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Cluc
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G；
[0014]2)构建含待测蛋白A编码基因的入门表达载体1、含待测蛋白B编码基因的入门表达载体2和含GFP基因的入门表达载体3；
[0015]3)构建融合表达载体：通过LR反应将入门载体1的待测蛋白A编码基因重组克隆到P
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Cluc
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G中多肽片段Cluc的C端，得到融合表达载体P
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Cluc
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A；将入门表达载体2中的待测蛋白B编码基因重组克隆到P
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Nluc
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G中多肽片段Nluc的N端，得到融合表达载体P
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Nluc
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B；
[0016]通过LR反应分别将GFP基因重组克隆到P
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Nluc
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G中多肽片段Nluc的N端、P
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Cluc
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G中多肽片段Cluc的N端，获得对照融合表达载体P
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Nluc
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GFP和P
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Cluc
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GFP；
[0017]4)利用Wheat Germ Extract蛋白表达系统/Reticulocyte Lysate System/Reticulocyte Lysate本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测蛋白互作的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)构建表达荧光素酶N端2～417位多肽片段Nluc的N端载体P
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Nluc
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G，以及表达荧光素酶398～550位多肽片段Cluc的C端载体P
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Cluc
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G；2)构建含待测蛋白A编码基因的入门表达载体1、含待测蛋白B编码基因的入门表达载体2和含GFP基因的入门表达载体3；3)构建融合表达载体：通过LR反应将入门载体1的待测蛋白A编码基因重组克隆到P
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Cluc
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G中多肽片段Cluc的C端，得到融合表达载体P
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Cluc
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A；将入门表达载体2中的待测蛋白B编码基因重组克隆到P
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Nluc
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G中多肽片段Nluc的N端，得到融合表达载体P
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Nluc
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B；通过LR反应分别将GFP基因重组克隆到P
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Nluc
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G中多肽片段Nluc的N端、P
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Cluc
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G中多肽片段Cluc的N端，获得对照融合表达载体P
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Nluc
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GFP和P
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Cluc
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GFP；4)利用Wheat Germ Extract蛋白表达系统/Reticulocyte Lysate System/Reticulocyte Lysate System分别对N端融合表达载体P
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Nluc
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B、C端融合表达载体P
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Cluc
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A、对照融合表达载体P
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Nluc
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GFP和P
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Cluc
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GFP进行体外翻译，然后将表达GFP、蛋白A和蛋白B中的蛋白两两混合，获得表达A/B、A/GFP、B/GFP蛋白的混合液，加入荧光素酶底物，检测信号强度，根据检测信号判定待测蛋白A和待测蛋白B是否存在互作关系。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)包括：用限制性内切酶SacⅠ和HindⅢ对表达载体pIX
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Halo进行酶切，回收线性载体片段pIX
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M；以pIX
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Halo载体为模板扩增获得AttR片段；分别以载体pCAMBIA1300
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nLUC和pCAMBIA1300
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cLUC为模板扩增获得Nluc和Cluc片段；通过Clone Enzyme重组酶将pIX
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M、Nluc片段和AttR片段按顺序重组，获得P
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Nluc
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G载体；将pIX
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M、AttR片段和Cluc片段按顺序重组获得P
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Cluc
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G载体。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)包括：采用带有attB重组位点的引物分别扩增待测蛋白A的编码基因和待测蛋白B的编码基因，获得BP反应重组的PCR产物1和PCR产物2；将所述PCR产物1和PCR产物2分别连接至pDONR载体中，获得入门载体1和入门载体2。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述室温孵育的时间为20分钟。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述荧光素底物为D
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Luciferin钾盐。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述判定方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：路则府，李晓松，裴洪翠，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：