基因组编辑表达框、载体及其应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因编辑领域，具体涉及基因组编辑表达框、包含该表达框的载体及其应用。本发明专利技术要解决的技术问题是在植物，特别是裸子植物目前没有适用的高效基因编辑系统。本发明专利技术解决技术问题的技术方案是提供一种基因组编辑表达框，该基因组编辑表达框包括以下元件：启动子LarPE004、Cas9蛋白编码基因、sgRNA克隆及转录单元，由启动子LarPE004驱动Cas9蛋白编码基因和sgRNA克隆及转录单元表达。本发明专利技术表达框架及相应载体在植物中能实现高效的基因编辑。实验表明在落叶松原生质体中基因编辑效率可达72.5％，同时还能在PAM为NGG、NAG、NGT等多个PAM位点均有较高的基因编辑活性，具有广阔的应用前景。有广阔的应用前景。有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
基因组编辑表达框、载体及其应用


[0001]本专利技术属于植物基因编辑领域，具体涉及基因组编辑表达框、包含该表达框的载体及其应用。

技术介绍

[0002]植物基因组编辑技术(PlantGenome Editing Technology)是指利用基因组编辑工具人为对植物的基因组DNA进行编辑，引入事先预定的碱基插入、删除、替换等突变形式，使植物基因组DNA遵照人为意愿发生定向的改变。植物基因组编辑工具经过十余年探索进化，目前已经专利技术出了应用成簇的规律间隔的短回文重复序列-效应核酸酶(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-associated Cas,CRISPR-Cas)系统进行植物基因组编辑的第三代工具。CRISPR-Cas基因组编辑工具具有实验成本低、载体构建容易、检测速度快、可开发性强等优点，是目前在植物基因组编辑工作中所用最为广泛的工具。研究人员应用CRISPR-Cas系统已成功在多种模型植物，如烟草、拟南芥中；多种农作物，如小麦、玉米、水稻、高粱中；多种木本植物，如苹果、葡萄、柑橘中；多种草本植物，如黄瓜、土豆、番茄中搭建了包括基因敲除、单碱基编辑、基因精准插入在内的基因组编辑平台，并取得较大进展，在拟南芥、水稻等模式植物中部分基因位点也取得了较高的编辑效率。
[0003]落叶松(Larix kaempferi)是一种寒温带及温带落叶乔木，具有早期速生、抗逆抗病性强、适应性广、强涵养水源性、生态效益好的特点，是我国北方及南方亚高山地区十分重要的造林树种，其在固碳、保水及用材方面发挥着重要作用，对维护生态平衡、抗洪抗灾具有直接作用，被广泛应用于防护林及退耕还林建设，也是人工林树种的主要选择之一。目前，我国主要通过传统育种方式如良种选育、种间杂交等方式进行落叶松遗传改良，但由于落叶松育种周期长、无性扩繁技术复杂且效率低、传统育种方式耗时耗力，一定程度上制约了其遗传改良进程，不能满足现代林木遗传育种的需求。本专利技术旨在于落叶松体内建立出一套高效基因组编辑的工具，促进落叶松遗传性状定向改良研究进展。随着现代基因工程技术的日趋成熟及基于CRISPR-Cas基因组编辑技术的发展，为落叶松重要性状快速改良带来了机遇。
[0004]但是，由于不同植物物种的基因组结构及表达特性不同，因此不同基因组编辑工具于不同植物物种中工作效率不尽相同。在不同植物物种中需要选择不同启动子、Cas蛋白和设计不同的向导RNA来构建适应本物种的基因编辑表达调控体系。由于落叶松属于裸子植物，裸子植物中基因工程进展缓慢，目前尚未有成功于落叶松体内实现基因组编辑的报道，导致应用此新兴技术定向改良落叶松遗传性状的研究发展缓慢。因此建立一套可以进行落叶松高效基因组编辑的工具对落叶松及相关植物的基因组工程研究和开发具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是在植物，特别是裸子植物，尤其特别是松科植物目前没有适用的高效基因编辑系统。
[0006]本专利技术解决技术问题的技术方案是提供一种基因组编辑表达框。该基因组编辑表达框包括以下元件：启动子LarPE004、Cas9蛋白编码基因、sgRNA克隆及转录单元，由启动子LarPE004驱动Cas9蛋白编码基因和sgRNA克隆及转录单元表达。
[0007]其中，上述的基因组编辑表达框中所述启动子LarPE004如下a)或b)或c)：
[0008]a)、核苷酸序列为Seq ID No.1所示；
[0009]b)、与a)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上或者90％以上同源性，且具有启动子功能
[0010]c)、或者能在严格条件下与a)或b)限定的启动子杂交，且具有启动子功能的DNA片段。
[0011]其中，上述的基因组编辑表达框中所述的Cas9蛋白为Cas9(Lar_spRY)。Cas9(Lar_spRY)的氨基酸序列Seq ID No.2所示。
[0012]其中，上述的基因组编辑表达框中所述的Cas9蛋白编码基因后还连接有NLS蛋白的编码基因。
[0013]进一步的，上述基因组编辑表达框的结构为：LarPE004-Cas9-NLS-polyA-tRNA-CCDB-sgRNA scaffold-tRNA-HspT。
[0014]其中所述Cas9为Cas9编码基因，所述NLS为核定位信号；所述polyA为多聚腺苷酸尾巴；所述tRNA为转运RNA；所述CCDB为毒素蛋白CcdB的编码基因；所述sgRNA scaffold为sgRNA克隆及转录单元；所述的HspT为水稻HSP终止子，所述的sgRNA克隆及转录单元为1、2、3、4、5、或6个。
[0015]优选的，其中的Cas9蛋白为Cas9(Lar_spRY)。Cas9(Lar_spRY)的氨基酸序列Seq ID No.2所示。
[0016]在具体构建表达框或骨架载体时，需注意每增加1个sgRNA克隆及转录单元，需用tRNA元件与相邻的sgRNA克隆及转录单元和表达框最后的HspT区隔开来。
[0017]其中，上述的基因组编辑表达框的核苷酸序列如Seq ID No.3中的9bp-7427bp所示。
[0018]本专利技术还提供了上述的基因组编辑表达框在制备基因组编辑载体中的用途。
[0019]本专利技术也还提供了上述含有上述基因组编辑表达框的基因组编辑载体。
[0020]进一步的，上述基因组编辑载体是可以基于本领域的基因编辑骨架载体构建。比如，可采用pTX171、pGEL031或pZHY988中的至少一种。
[0021]本专利技术也提供了上述基因组编辑表达框或基因组编辑载体在进行植物基因组编辑中的用途。进一步的，所述的植物为裸子植物或被子植物。优选的，所述的裸子植物为松科植物。更优选的，所述的松科植物为落叶松。
[0022]本专利技术还提供了一种对植物进行基因组编辑的方法。该方法包括以下步骤：
[0023]a)、针对待编辑的目标基因设计基因编辑位点及sgRNA；
[0024]b)、构建权利要求9任一项所述的基因组编辑载体，其中过构建入步骤a)所述的目的基因的sgRNA；
[0025]c)、使用步骤b)获得的基因组编辑载体转化植物细胞或组织，诱导再生得到基因编辑的植物植株。
[0026]进一步的，所述的植物为裸子植物或被子植物。优选的，所述的裸子植物为松科植物。更优选的，所述的松科植物为落叶松。
[0027]本专利技术的有益效果在于提供了一种高效的CRISPR-Cas9基因编辑系统用表达框架以及相应的基因编辑表达载体。本专利技术表达框架及相应载体尤其适用于在落叶松中进行基因编辑。实验表明，本专利技术表达框架及相应载体在落叶松原生质体中基因编辑效率可达72.5％。同时还能在PAM为NGG、NAG、NGT等多个PAM位点均有较高的基因编辑活性，在落叶松遗传性状定向改良研究方向有广阔的应用前景。
附图说明
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基因组编辑表达框，其特征在于，包括以下元件：启动子LarPE004、Cas9蛋白编码基因基因、sgRNA克隆及转录单元，由启动子LarPE004驱动Cas9蛋白编码基因和sgRNA克隆及转录单元。2.根据权利要求1所述的基因组编辑表达框，其特征在于：所述启动子LarPE004如下a)或b)或c)：a)、核苷酸序列为Seq ID No.1所示；b)、与a)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上或者90％以上同源性，且具有启动子功能；c)、或者能在严格条件下与a)或b)限定的启动子杂交，且具有启动子功能的DNA片段。3.根据权利要求1所述的基因组编辑表达框，其特征在于：所述Cas9蛋白的氨基酸序列Seq ID No.2所示。4.根据权利要求1所述的基因组编辑表达框，其特征在于：所述Cas9蛋白编码基因后还连接有NLS蛋白的编码基因。5.根据权利要求1所述的基因组编辑表达框，其特征在于其结构为：启动子LarPE004-Cas9-NLS-polyA-tRNA-CCDB-sgRNA scaffold-tRNA-HspT；所述Cas9为Cas9编码基因，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张勇，任秋蓉，郑雪莲，黄兰，唐旭，
申请(专利权)人：电子科技大学，
类型：发明
国别省市：