石龙芮体细胞胚介导的遗传转化方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及石龙芮体细胞胚介导遗传转化的方法。本发明专利技术可快速、高效诱导出石龙芮体细胞胚结构，可以通过“外植体侵染

【技术实现步骤摘要】
石龙芮体细胞胚介导的遗传转化方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及石龙芮体细胞胚介导的遗传转化方法。

技术介绍

[0002]石龙芮是一种毛茛科中草药，富含药用价值较高的次生代谢物，包括生物碱、单宁、黄酮类化合物、异黄酮和原儿茶醛。长期以来，石龙芮一直被中国传统医学用来防止乙型肝炎病毒HBV和单纯疱疹病毒1型HSV
‑
1的复制，其还可用于治疗黄疸、风湿性疼痛、哮喘和小便失禁。同时，石龙芮也是控制黑腹果蝇和赤拟谷盗等害虫非常有效的杀虫剂。此外，石龙芮具有较强的污水处理能力，能吸收大量氮、磷，积累和监测土壤中重金属的含量变化，如铜、铅、铁、锌等。
[0003]现有技术对毛茛科植物的研究多集中于该科植物的次生代谢物质的活性检测、毒性与活性成分组分分析，土壤重金属与有机污染物的清除与净化，以及二倍体黑种草、耧斗菜等观赏性毛茛科植物花器官的发育机制等方面。多种毛茛科植物的常规无菌苗培养过程尚且存在一些技术难度，如种子萌发率、发芽势的同步率、无菌苗的继代培养等。关于毛茛科植物体细胞胚发生及其介导的高效再生、常规再生体系以及遗传转化体系均无可参考的现行体系。石龙芮体细胞胚介导的高效再生与遗传转化等体系建立存在诸多技术瓶颈：如培养基筛选、种子催芽、植物生长调节剂种类与浓度筛选、最佳外植体的筛选以及农杆菌侵染时段的选择等。因此，石龙芮体细胞胚介导的高效再生与遗传转化体系方面未有研究报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供石龙芮体细胞胚介导遗传转化的方法。
>[0005]根据本专利技术具体实施方式的石龙芮体细胞胚介导遗传转化的方法，所述方法包括以下步骤：
[0006](1)将石龙芮种子消毒，播于MS培养基中，进行无菌苗培养，其中MS培养基包括以下组分：MS盐、B5有机、30g/L蔗糖、7.8g/L琼脂粉，MS培养基的pH为5.8；
[0007](2)选择无菌苗的营养器官为外植体，在转化侵染介质中进行农杆菌转化介质侵染；
[0008](3)将侵染后的外植体平铺于共培养培养基中进行共培养；
[0009](4)将共培养后的外植体转入含有抗生素的体细胞胚诱导培养基中进行体细胞胚的诱导发生以及抗性体细胞胚的筛选，其中，体细胞胚诱导培养基包括以下组分：MS盐、B5有机、10.0mg/LNAA、30g/L蔗糖、3.6g/L结冷胶，体细胞胚诱导培养基的pH为5.8；
[0010](5)将抗性体细胞胚置于生根培养基中，于光照条件下诱导胚体生根，其中，生根培养基包括以下组分：1/2MS盐、1/2B5有机、0.1mg/LNAA、15g/L蔗糖、7.8g/L琼脂粉，生根培养基的pH为5.8；
[0011](6)炼苗、移栽。
[0012]根据本专利技术具体实施方式的石龙芮体细胞胚介导遗传转化的方法，步骤(2)中，转化侵染介质包括以下组分：MS盐、B5有机、15g/L葡萄糖，转化侵染介质的pH为5.8。
[0013]根据本专利技术具体实施方式的石龙芮体细胞胚介导遗传转化的方法，步骤(3)中，共培养培养基包括以下组分：MS盐、B5有机、40mg/L乙酰丁香酮、30g/L蔗糖、7.8g/L琼脂粉，共培养培养基的pH为5.8。
[0014]根据本专利技术具体实施方式的石龙芮体细胞胚介导遗传转化的方法，步骤(4)中，体细胞胚诱导培养基含有100mg/L硫酸卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素钠。
[0015]根据本专利技术具体实施方式的石龙芮体细胞胚介导遗传转化的方法，步骤(5)中，将抗性体细胞胚置于25℃，16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m
‑2s
‑1条件下诱导生根。
[0016]本专利技术的有益效果：
[0017]本专利技术可快速、高效诱导出石龙芮体细胞胚结构，可以通过“外植体侵染
‑
体细胞胚诱导”方法成功转化外源基因，所建立的石龙芮体细胞胚介导的遗传转化体系具有快速、高效、嵌合率低、可稳定遗传等特点。
附图说明
[0018]图1显示石龙芮体细胞胚不同的发育阶段；其中，A为石龙芮叶片外植体诱导出的多个体细胞胚结构；B为球形胚；C为球形
‑
心形过渡胚；D、E、F和G为心形胚；H为鱼雷胚；I、J、K和L为子叶胚；
[0019]图2显示体细胞胚介导的石龙芮再生情况；其中，A为由石龙芮叶片外植体诱导出的不同发育阶段的体细胞胚结构；B为体细胞胚发育流程，显示具有不同子叶数的子叶胚；C为成熟胚；D为体细胞胚生根诱导；E为体细胞胚再生苗；F为石龙芮再生植株；F1和F2为石龙芮再生植株花器官；
[0020]图3显示过表达RcLEC1
‑
B导致石龙芮的矮化与花器官畸形；其中，A、A1、A2和B为石龙芮遗传转化过程，由根、茎、叶诱导出处于不同阶段的硫酸卡那霉素(Kan
+
)阳性胚体；A为石龙芮根外植体；A1为石龙芮茎外植体；A2和B为石龙芮叶外植体；C1为石龙芮阳性胚体的GUS染色；C2为石龙芮阳性花器官的GUS染色；D和D1为石龙芮野生植株(15d)；E和E1为石龙芮空载植株(pCAMBIA2300，15d)；D2为石龙芮野生植株(30d)；E2为石龙芮空载植株(pCAMBIA2300，30d)；F和F1为具有矮化表型的RcLEC1
‑
B
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OE石龙芮植株(15d)；F2为RcLEC1
‑
B
‑
OE石龙芮植株(30d)；G为具有角质层缺陷表型的RcLEC1
‑
B
‑
OE石龙芮植株(15d)；
[0021]图4显示RcLEC1
‑
B
‑
OE石龙芮与野生型植株的花器官形态与数量，其中，A具有5个萼片、5个花瓣和16个雄蕊和1个总雌蕊；B
‑
B16为RcLEC1
‑
B
‑
OE石龙芮花器官；B、B2、B3、B4、B5、B6、B7和B10为RcLEC1
‑
B
‑
OE石龙芮花器官中具有畸形的花瓣状结构；B4为RcLEC1
‑
B
‑
OE石龙芮花器官中具有介于花瓣与萼片的过渡态结构；B
‑
B16为不具有花瓣与雄蕊结构的RcLEC1
‑
B
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OE石龙芮花器官；
[0022]图5显示石龙芮根、茎和叶的体细胞胚诱导发生情况，其中，A
‑
C为发育早期的石龙芮体细胞胚；A1
‑
C1为发育晚期的石龙芮体细胞胚；A和A1为根外植体；B和B1为茎外植体；C和C1为叶外植体。
具体实施方式
[0023]本专利技术所用培养基见表1：
[0024]表1本专利技术所用培养基名称缩写、名称与组分
[0025][0026][0027]实施例1
[0028](1)无菌苗培养：选择健康饱满的石龙本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.石龙芮体细胞胚介导的遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将石龙芮种子消毒，播于无菌苗培养基中，进行无菌苗培养；(2)选择无菌苗的营养器官为外植体，在转化侵染介质中进行农杆菌转化介质侵染；(3)将侵染后的外植体平铺于共培养培养基中进行共培养；(4)将共培养后的外植体转入含有抗生素的体细胞胚诱导培养基中进行体细胞胚的诱导发生以及抗性体细胞胚的筛选，其中，体细胞胚诱导培养基包括以下组分：MS盐、B5有机、10.0mg/L NAA、30g/L蔗糖、7.8g/L琼脂粉，体细胞胚诱导培养基的pH为5.8；(5)将抗性体细胞胚置于生根培养基中，于光照条件下诱导胚体生根，其中，生根培养基包括以下组分：1/2MS盐、1/2B5有机、0.1mg/L NAA、15g/L蔗糖、7.8g/L琼脂粉，生根培养基的pH为5.8；(6)炼苗、移栽。2.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐克东，李成伟，张怡，张菊，李晓丽，常云霞，于德水，
申请(专利权)人：周口师范学院，
类型：发明
国别省市：