一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法及其应用技术

本发明专利技术涉及植物培养技术领域，具体涉及一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法及其应用，包含了植物培养，侵染液制备，匍匐茎离体注射和毛状根诱导，以草莓小苗作为试验材料，对草莓小苗进行草莓匍匐茎离体注射、离体抽真空和活体注射方法的比较，筛选出活体注射法后，用携带有pCAMBIA1302和pCAMBIA1302

【技术实现步骤摘要】
一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法及其应用


[0001]本专利技术涉及植物培养
，具体涉及一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法及其应用。

技术介绍

[0002]草莓是蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)多年生草本浆果果树，草莓果实中的营养价值丰富，含有多种维生素、苹果酸、柠檬酸、Ca、Fe、鞣酸、胡萝卜素和花青素等营养物质，因果大味美，被誉为“水果皇后”。
[0003]发根农杆菌是一种可以侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物的革兰氏阴性菌，它在侵染植物时将它携带的Ri质粒中的T
‑
DNA导入被侵染植物的基因组中，受到侵染的植物伤口处会产生毛状根。发根农杆菌诱导所得的毛状根分化程度高且可以自主生长，是常见的试验材料。现有研究中还没有对草莓匍匐茎进行活体注射并通过农杆菌诱导建立草莓转基因毛状根诱导的方法。
[0004]鉴于上述缺陷，本专利技术创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于解决如何对草莓匍匐茎进行活体注射并通过农杆菌诱导建立草莓转基因毛状根诱导的问题，提供了一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法及其应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术公开了一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法，包括以下步骤：
[0007]S1：转基因菌液制备：用携带有pCAMBIA1302载体的K599发根农杆菌摇菌至OD
600
≈0.2～0.4，富集菌液，离心后用含有乙酰丁香酮的侵染液轻柔重悬，得到侵染菌液；
[0008]S2：侵染：采用步骤S1中得到的侵染菌液对盆栽草莓进行草莓匍匐茎活体注射；
[0009]S3：毛状根诱导：对步骤S2中经过活体注射后的草莓苗用湿棉花保湿，用黑塑料布覆盖，暗培养3d，得到毛状根。
[0010]所述步骤S1中离心的转速为5000r/min，离心时间为5min。。
[0011]所述步骤S1侵染液包括10mmol/L的MES、10mmol/L的MgCl2、0.5mmol/L的乙酰丁香酮，采用灭菌水定容。
[0012]所述步骤S2中草莓匍匐茎活体注射是采用侵染菌液在2～3幼叶小苗的匍匐茎上端0.5～1cm内进行草莓匍匐茎活体注射。
[0013]所述步骤S2中活体注射的侵染菌液OD
600
为0～1。
[0014]所述步骤S3中草莓苗注射伤口处需要用一端泡在水中的纱布覆盖保湿。
[0015]本专利技术还公开了上述草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法在章姬草莓、红颜草莓、白雪公主草莓中的应用。
[0016]与现有技术比较本专利技术的有益效果在于：
[0017]1、本专利技术以草莓小苗作为试验材料，对草莓小苗进行草莓匍匐茎离体注射、离体抽真空和活体注射方法的比较，筛选出活体注射法后，用携带有pCAMBIA1302载体的K599发根农杆菌进行匍匐茎注射，获得转基因毛状根，并通过PCR和荧光显微观察确定为转基因毛状根，本专利技术成功建立了草莓匍匐茎生长转基因毛状根诱导体系，研究了草莓毛状根最佳诱导方法，对草莓基因研究有重要意义；
[0018]2、本专利技术采用的侵染方法是盆栽草莓匍匐茎活体注射的方法，此方法简单易行，区别于温郁金毛状根中的外植体组培诱导，活体注射可在大田培养时完成，不需要组培的无菌条件和脱菌繁殖，就已经可以成功获得转基因毛状根，并且与清水组进行对比确定了此方法的可行性；
[0019]3、本专利技术活体注射方法诱导率高，红颜草莓匍匐茎毛状根诱导率达到50％，白雪公主草莓匍匐茎毛状根诱导率达到60％；
[0020]4、本专利技术中毛状根注射位于草莓匍匐茎上端位点，区别于植物本身根系生长位置，较容易确定为转基因毛状根，转基因毛状根鉴定率较高，实验用活体注射法所得毛状根经过鉴定，100％均为转基因毛状根，有利于后期基因的功能验证。
附图说明
[0021]图1为草莓毛状根诱导活体注射方法，(A)为草莓匍匐茎的不同注射点，(B)注射后草莓注射点的培养方法，(C)草莓匍匐茎的不同老嫩程度，横线为5mm；
[0022]图2不同嫩度匍匐茎注射后表皮变化情况，Control注射不含菌液的侵染液，Young、Mature和Old注射含pCAMBIA1302载体的K599发根农杆菌，横线为5mm；
[0023]图3为草莓匍匐茎毛状根生长过程，(A)注射前，(B)注射后35d，(C)注射后40d，(D)注射后60d，横线为5mm；
[0024]图4为转pCAMBIA1302
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FaNRT1.1和pCAMBIA1302毛状根的电泳检测结果，(A)和(B)为转pCAMBIA1302
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FaNRT1.1和pCAMBIA1302的毛状根；
[0025]图5为转pCAMBIA1302
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FaNRT1.1草莓毛状根的荧光信号，FaNRT 1.1为转pCAMBIA1302
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FaNRT1.1的草莓毛状根，WT为草莓水培根，横线为25μm；
[0026]图6为转pCAMBIA1302
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FaNRT1.1和pCAMBIA1302的草莓匍匐茎毛状根；
[0027]图7为FaNRT1.1的过表达对草莓根系硝酸盐转运活性的影响；
[0028]图8为转pHellsgate2
‑
FaNRT1.1和pHellsgate2的毛状根电泳检测结果；
[0029]图9为转pHellsgate2
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FaNRT1.1和pHellsgate2的草莓匍匐茎毛状根；
[0030]图10为FaNRT1.1基因的沉默表达对草莓根系硝酸盐转运活性的影响。
具体实施方式
[0031]以下结合附图，对本专利技术上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
[0032]一、诱导草莓匍匐茎生长转基因毛状根的方法
[0033]1、基本侵染方法的筛选
[0034]用携带有pCAMBIA1302载体的K599发根农杆菌摇菌至OD
600
≈0.2
‑
0.4，富集菌液，5000r/min离心5min，弃上清，用侵染液[MES(10mmol/L)，MgCl2(10mmol/L)，Ace(乙酰丁香酮)(0.5mmol/L)，灭菌水定容]轻柔重悬，重复用侵染液清洗1次，最后用侵染液定容，用于
注射或处理草莓匍匐茎。
[0035]选取的草莓小苗进行草莓匍匐茎离体注射、离体抽真空和活体注射方法的比较。剪取草莓10
‑
15d匍匐茎上2
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3幼叶的小苗，保留匍匐茎上段1.5cm；用含发根农杆菌的侵染液在匍匐茎近小苗0.5
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1cm内进行草莓匍匐茎离体注射；具有基部伤口的离体小苗整株泡在侵染液中，在0.8MPa下抽真空30min，进行草莓匍匐茎离体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：转基因菌液制备：用携带有pCAMBIA1302载体的K599发根农杆菌摇菌至OD
600
≈0.2～0.4，富集菌液，离心后用含有乙酰丁香酮的侵染液轻柔重悬，得到侵染菌液；S2：侵染：采用步骤S1中得到的侵染菌液对盆栽草莓进行草莓匍匐茎活体注射；S3：毛状根诱导：对步骤S2中经过活体注射后的草莓苗用湿棉花保湿，用黑塑料布覆盖，暗培养3d，得到毛状根。2.如权利要求1所述的一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法，其特征在于，所述步骤S1中离心的转速为5000r/min，离心时间为5min。3.如权利要求1所述的一种草莓匍匐茎生长转基因毛状根的诱导方法，其特征在于，所述步骤S1侵染液包括10mmol...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝福玲，吴沐谦，张露露，孙启涵，吴思鑫，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：